香蕉枯萎病菌古巴专化型cat1和CcP基因的功能鉴定

发布时间：2022-02-21 18:33

　　由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的香蕉枯萎病是一种具有毁灭性的土传维管束病害,目前还没有一种防治效果理想的化学药剂,且化学防治存在田间药剂流失严重、危害环境和人类的健康等问题。因此,培育抗病品种成为十分迫切的替代策略。探讨尖孢镰刀菌的致病相关基因的功能,可以深入了解尖孢镰刀菌的致病机理,有利于抗病育种研究。前期蛋白质组学研究发现尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种（Foc4）中的过氧化氢酶1 （cat1）基因和细胞色素c过氧化物酶（CcP）基因受到巴西蕉诱导上调表达,为研究cat1和CcP基因在Foc4侵染香蕉过程中的作用,利用同源重组方法分别敲除Foc4的cat1和CcP基因,并对敲除子进行了回复,而后对敲除子/回复子进行了表型分析和致病性测定。结果如下:1.成功扩增Foc4的cat1基因和CcP基因左右侧同源臂,并构建了带GFP （绿色荧光蛋白）标记的敲除载体。2.利用PEG介导的原生质体转化法,对Foc4菌株进行了基因敲除,获得带有绿色荧光蛋白和潮霉素B双标记的cat1基因缺失突变体和CcP基因缺失突变体。通过融合PCR方法构建对应的转化片段,转化敲除子,得到带有G418抗性的cat1基因回复... 

【文章来源】：海南大学海南省211工程院校

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1. 导论
    1.1 尖孢镰刀菌
        1.1.1 尖孢镰刀菌简介
        1.1.2 尖孢镰刀菌致病机理
    1.2 香蕉枯萎病
        1.2.1 香蕉枯萎病的发生与危害
        1.2.2 香蕉枯萎病的发病症状
        1.2.3 香蕉枯萎病的防治
    1.3 植物病原真菌中的氧化应激反应
        1.3.1 氧化应激反应
        1.3.2 过氧化氢酶
        1.3.3 细胞色素c过氧化物酶
    1.4 融合PCR法构建同源重组DNA片段
    1.5 本研究的目的及意义
2. 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 试剂及配方
        2.1.3 培养基及配方
        2.1.4 仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 cat1和CcP全长基因的克隆
        2.2.2 cat1和CcP基因克隆载体的构建
        2.2.3 cat1和CcP基因敲除载体的构建
        2.2.4 尖孢镰刀菌PEG转化
        2.2.5 基因敲除转化子的鉴定
        2.2.6 突变体菌株表型观察
        2.2.7 致病性测定
        2.2.8 数据处理
        2.2.9 cat1和CcP基因功能回复验证
3. 结果与分析
    3.1 全长基因的克隆
    3.2 克隆载体的构建
        3.2.1 同源臂的扩增
        3.2.2 克隆载体的酶切鉴定
    3.3 基因敲除载体的构建
        3.3.1 cat1-A-pCT74和CcP-B-pCT74载体酶切鉴定
        3.3.2 B-cat1-A-pCT74和A-CcP-B-pCT74载体酶切鉴定
        3.3.3 敲除转化片段的PCR扩增
    3.4 原生质体的制备
    3.5 敲除转化子的鉴定
        3.5.1 转化子的绿色荧光检测
        3.5.2 转化子的PCR验证
    3.6 回复转化片段的构建
        3.6.1 三个片段的PCR扩增
        3.6.2 回复片段的PCR扩增
    3.7 回复转化子的PCR鉴定
    3.8 敲除子/回复子的表型分析
        3.8.1 菌落形态观察
        3.8.2 玻璃纸穿透实验
        3.8.3 纤维素利用实验
        3.8.4 过氧化氢耐受性实验
        3.8.5 渗透压胁迫实验
        3.8.6 细胞壁选择性压力实验
    3.9 敲除子/回复子的致病力测定
        3.9.1 香蕉离体叶片实验
        3.9.2 香蕉盆栽苗致病力测定
        3.9.3 病情指数和发病率统计
4. 讨论
    4.1 敲除和互补载体的构建
    4.2 PEG介导的原生质体转化
    4.3 转化子的检测鉴定
    4.4 敲除突变体的表型分析
    4.5 敲除突变体致病力的测定
    4.6 回复子功能验证
5. 结论
参考文献
附录
基金项目
论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因敲除与表型分析[J]. 王飞燕,郭立佳,杨腊英,汪军,王国芬,黄俊生.  热带作物学报. 2015(08)
[2]香蕉枯萎镰刀菌致病性快速测定方法的建立[J]. 符冬妹,陈汉清,郭素霞,王婷婷,曾会才.  基因组学与应用生物学. 2015(02)
[3]几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化[J]. 黄东杰,彭明,李春强.  热带农业科学. 2014(01)
[4]FoAP1基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的功能分析[J]. 齐兴柱,杨腊英,郭立佳,黄俊生.  植物病理学报. 2013(06)
[5]香蕉枯萎病病原菌的研究进展[J]. 李斌,盛鸥,李春雨,魏岳荣,左存武,胡春华,易干军,罗充.  分子植物育种. 2013(05)
[6]尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究[J]. 蒋艳琴,曾涛,陈汉清,林妃,袁贵祥,郭刚,曾会才.  基因组学与应用生物学. 2013(03)
[7]长片段融合PCR在构建烟曲霉rho1基因回补株中的应用[J]. 韩改革,贾晓东,韩雪琳,赵帅,韩黎.  中国真菌学杂志. 2013(03)
[8]黄瓜种传镰刀菌种类的鉴定及其致病性研究[J]. 蒋荷,李旭,郑慧慧,吴学宏,杨腊英.  中国农业大学学报. 2013(02)
[9]一种载体构建的新方法:重组融合PCR法[J]. 邝翡婷,袁定阳,李莉,李新奇.  基因组学与应用生物学. 2012(06)
[10]香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定[J]. 李敏慧,余雄涛,王鸿飞,周佳暖,习平根,姜子德.  中国农业科学. 2012(19)

博士论文
[1]几个抗氧化胁迫相关基因在香蕉枯萎病菌致病中的作用研究[D]. 齐兴柱.海南大学 2013

硕士论文
[1]丝状真菌遗传转化系统的建立[D]. 周庆新.山东农业大学 2007



本文编号：3637825