百合体胚发生过程中pre-miR171及eTM171表达分析与载体构建
发布时间：2022-02-26 19:22
百合是世界著名的球根花卉,具有较高的观赏价值。然而目前大量珍贵野生资源濒临灭绝,种质保存方面尚存在困难,国内拥有自主知识产权的品种较少。体细胞胚发生对于解决百合种质保存、遗传性状改良、种球繁育等问题具有重要意义,但目前有关于百合体胚发生的相关分子机制研究尚未明确。本课题组研究表明miR171在调控百合体胚发生过程中起到重要作用,本研究克隆了细叶百合（Lilium pumilum DC.Fisch）miR171前体（pre-miR171）;使用qRT-PCR技术探讨百合体细胞胚发生过程中pre-miR171及内源诱捕靶标（eTM171）的表达模式;使用双酶切方法进行miR171过表达载体的构建,并采用小串联模拟靶标技术及CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了mi R171沉默和敲除载体,为揭示百合体胚发生过程中miR171的产生、加工和调控过程,以及深入研究百合体胚发生过程中eTM-miR171-SCL6的调控网络奠定了基础。主要试验结果如下:1.lpu-pre-miR171a/b的克隆及表达分析根据miRNA前体具有高度保守的特点,成功克隆得到了细叶百合lpu-miR171a、lpu...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
1.1 百合体细胞胚发生的最新研究进展
1.2 植物体细胞胚发生过程中关键miRNA的研究进展
1.2.1 植物miRNA的生物合成
1.2.2 miRNA成熟体参与调控植物体胚发生的研究进展
1.2.3 miRNA前体在体胚发生过程中的研究进展
1.3 miR171的研究进展
1.3.1 miR171家族的研究进展
1.3.2 miR171调控植物体细胞胚发生的研究进展
1.4 植物内源诱捕靶标(eTM)的研究进展
1.5 植物miRNA功能的研究进展
1.6 CRISPR/Cas9技术在园艺植物基因组编辑中的研究进展
1.7 本文研究的目的与意义
2 细叶百合pre-miR171a/b的克隆及表达分析
2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试验仪器设备及耗材
2.1.3 常用试剂及培养基的配制
2.1.4 百合体胚总RNA提取及cDNA合成
2.1.5 pre-miR171a/b的PCR扩增反应
2.1.6 PCR扩增产物的纯化、连接、转化及测序
2.1.7 对测序结果进行生物信息学分析
2.1.8 pre-miR171的qRT-PCR分析
2.1.9 数据分析
2.2 结果与分析
2.2.1 细叶百合体细胞胚总RNA提取结果
2.2.2 lpu-pre-miR171a/b的克隆
2.2.3 lpu-pre-miR171a/b二级结构预测
2.2.4 pre-miR171a/b引物特异性分析
2.2.5 百合体胚发生过程中pre-miR171的表达分析
2.3 讨论
2.3.1 pre-miR171a/b序列分析
2.3.2 百合体胚发生过程中miR171与pre-miR171表达关联性分析
3 百合体胚发生过程中eTM171表达分析
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料
3.1.2 RNA提取及cDNA合成
3.1.3 eTM171的qRT-PCR引物设计
3.1.4 eTM171的qRT-PCR分析
3.1.5 数据分析
3.2 结果与分析
3.2.1 eTM171引物特异性分析
3.2.2 百合体胚发生过程中eTM171的表达分析
3.3 讨论
3.3.1 百合体胚发生过程中miR171及其eTM的表达关联性分析
3.3.2 百合体胚发生过程中eTM-miR171-SCL6调控网络初探
4 细叶百合miR171a/b的载体构建
4.1 材料与方法
4.1.1 主要试剂
4.1.2 试验所用的菌株与载体
4.1.3 miR171a/b过表达载体的构建
4.1.4 miR171a/bSTTM表达载体的构建
4.1.5 miR171a/b打靶载体的构建
4.2 结果与分析
4.2.1 miR171a/b过表达载体的构建
4.2.2 miR171a/bSTTM表达载体的构建
4.2.3 百合miR171a/b打靶载体的构建
4.3 讨论
结论
主要创新点
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表文章
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[2]龙眼miR171家族进化特性及其表达分析[J]. 曾友竞,林玉玲,崔彤彤,陈晓慧,徐小萍,张梓浩,程春振,陈裕坤,赖钟雄. 西北植物学报. 2017(02)
[3]Long Non-coding RNAs and Their Biological Roles in Plants[J]. Xue Liu,Lili Hao,Dayong Li,Lihuang Zhu,Songnian Hu. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2015(03)
[4]麻竹转录因子DlSCL6的基因克隆及在拟南芥中异位表达[J]. 杨丽,陈东亮,彭镇华,赵韩生,高志民. 林业科学. 2014(11)
[5]百合类体细胞胚和体细胞胚的形态学与组织学研究[J]. 吴泽,钟雄辉,曹兴,宫本贺,程运河,陈全全,义鸣放. 园艺学报. 2014(08)
[6]miRNA在植物重金属胁迫应答中的作用[J]. 张林,丁艳菲,王熠,朱诚. 植物生理学报. 2014(05)
[7]杨树MIR171基因家族进化与功能分化研究[J]. 刘志祥,曾超珍,曾渭贤,徐刚标,谭晓风. 植物遗传资源学报. 2014(02)
[8]Short Tandem Target Mimic:A Long Journey to the Engineered Molecular Landmine for Selective Destruction/Blockage of MicroRNAs in Plants and Animals[J]. Guiliang Tang,Xiaoqing Tang. Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[9]龙眼胚性愈伤组织miR398b前体克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析[J]. 林玉玲,赖钟雄. 热带作物学报. 2012(11)
[10]落叶松体胚发育中5个miRNA前体与成熟体的表达[J]. 张俊红,张守攻,吴涛,韩素英,杨文华,齐力旺. 植物学报. 2012(05)
博士论文
[1]两种中国原产百合体细胞胚发生及miRNA调控网络初步解析[D]. 张静.沈阳农业大学 2017
[2]MiRNA生物合成过程的系统动力学研究[D]. 王霞.西北农林科技大学 2013
硕士论文
[1]五种不同品系切花百合体细胞胚发生的组织形态学观察[D]. 聂茹霞.沈阳农业大学 2017
[2]两种中国原产百合体细胞胚发生发育的组织学初探[D]. 薛冰洋.沈阳农业大学 2017
[3]百合体胚发生过程中miR166及其靶基因的鉴定与表达分析[D]. 杨越.沈阳农业大学 2017
[4]基于体细胞胚发生的五种切花百合高效再生体系建立[D]. 严瑞.沈阳农业大学 2017
[5]百合体胚发生过程中miR171及其靶基因SCL6的鉴定与表达分析[D]. 贾娜娜.沈阳农业大学 2016
[6]Tae-miR9677前体及其小串联模拟靶标表达载体构建及小麦遗传转化研究[D]. 李赵杰.西北农林科技大学 2016
[7]白菜miR158的表达及其在花粉发育中的功能鉴定[D]. 马智明.浙江大学 2016
[8]野生百合高效再生体系建立及愈伤组织增殖调控研究[D]. 马怡迪.浙江大学 2015
[9]麝香百合胚性愈伤诱导及农杆菌介导的遗传转化体系的优化[D]. 张倩.华中农业大学 2013
[10]百合（Lilium）鳞茎薄层胚性愈伤组织诱导及再生植株遗传稳定性鉴定[D]. 陈龙.西北农林科技大学 2013
本文编号：3644978
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
1.1 百合体细胞胚发生的最新研究进展
1.2 植物体细胞胚发生过程中关键miRNA的研究进展
1.2.1 植物miRNA的生物合成
1.2.2 miRNA成熟体参与调控植物体胚发生的研究进展
1.2.3 miRNA前体在体胚发生过程中的研究进展
1.3 miR171的研究进展
1.3.1 miR171家族的研究进展
1.3.2 miR171调控植物体细胞胚发生的研究进展
1.4 植物内源诱捕靶标(eTM)的研究进展
1.5 植物miRNA功能的研究进展
1.6 CRISPR/Cas9技术在园艺植物基因组编辑中的研究进展
1.7 本文研究的目的与意义
2 细叶百合pre-miR171a/b的克隆及表达分析
2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试验仪器设备及耗材
2.1.3 常用试剂及培养基的配制
2.1.4 百合体胚总RNA提取及cDNA合成
2.1.5 pre-miR171a/b的PCR扩增反应
2.1.6 PCR扩增产物的纯化、连接、转化及测序
2.1.7 对测序结果进行生物信息学分析
2.1.8 pre-miR171的qRT-PCR分析
2.1.9 数据分析
2.2 结果与分析
2.2.1 细叶百合体细胞胚总RNA提取结果
2.2.2 lpu-pre-miR171a/b的克隆
2.2.3 lpu-pre-miR171a/b二级结构预测
2.2.4 pre-miR171a/b引物特异性分析
2.2.5 百合体胚发生过程中pre-miR171的表达分析
2.3 讨论
2.3.1 pre-miR171a/b序列分析
2.3.2 百合体胚发生过程中miR171与pre-miR171表达关联性分析
3 百合体胚发生过程中eTM171表达分析
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料
3.1.2 RNA提取及cDNA合成
3.1.3 eTM171的qRT-PCR引物设计
3.1.4 eTM171的qRT-PCR分析
3.1.5 数据分析
3.2 结果与分析
3.2.1 eTM171引物特异性分析
3.2.2 百合体胚发生过程中eTM171的表达分析
3.3 讨论
3.3.1 百合体胚发生过程中miR171及其eTM的表达关联性分析
3.3.2 百合体胚发生过程中eTM-miR171-SCL6调控网络初探
4 细叶百合miR171a/b的载体构建
4.1 材料与方法
4.1.1 主要试剂
4.1.2 试验所用的菌株与载体
4.1.3 miR171a/b过表达载体的构建
4.1.4 miR171a/bSTTM表达载体的构建
4.1.5 miR171a/b打靶载体的构建
4.2 结果与分析
4.2.1 miR171a/b过表达载体的构建
4.2.2 miR171a/bSTTM表达载体的构建
4.2.3 百合miR171a/b打靶载体的构建
4.3 讨论
结论
主要创新点
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表文章
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[2]龙眼miR171家族进化特性及其表达分析[J]. 曾友竞,林玉玲,崔彤彤,陈晓慧,徐小萍,张梓浩,程春振,陈裕坤,赖钟雄. 西北植物学报. 2017(02)
[3]Long Non-coding RNAs and Their Biological Roles in Plants[J]. Xue Liu,Lili Hao,Dayong Li,Lihuang Zhu,Songnian Hu. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2015(03)
[4]麻竹转录因子DlSCL6的基因克隆及在拟南芥中异位表达[J]. 杨丽,陈东亮,彭镇华,赵韩生,高志民. 林业科学. 2014(11)
[5]百合类体细胞胚和体细胞胚的形态学与组织学研究[J]. 吴泽,钟雄辉,曹兴,宫本贺,程运河,陈全全,义鸣放. 园艺学报. 2014(08)
[6]miRNA在植物重金属胁迫应答中的作用[J]. 张林,丁艳菲,王熠,朱诚. 植物生理学报. 2014(05)
[7]杨树MIR171基因家族进化与功能分化研究[J]. 刘志祥,曾超珍,曾渭贤,徐刚标,谭晓风. 植物遗传资源学报. 2014(02)
[8]Short Tandem Target Mimic:A Long Journey to the Engineered Molecular Landmine for Selective Destruction/Blockage of MicroRNAs in Plants and Animals[J]. Guiliang Tang,Xiaoqing Tang. Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[9]龙眼胚性愈伤组织miR398b前体克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析[J]. 林玉玲,赖钟雄. 热带作物学报. 2012(11)
[10]落叶松体胚发育中5个miRNA前体与成熟体的表达[J]. 张俊红,张守攻,吴涛,韩素英,杨文华,齐力旺. 植物学报. 2012(05)
博士论文
[1]两种中国原产百合体细胞胚发生及miRNA调控网络初步解析[D]. 张静.沈阳农业大学 2017
[2]MiRNA生物合成过程的系统动力学研究[D]. 王霞.西北农林科技大学 2013
硕士论文
[1]五种不同品系切花百合体细胞胚发生的组织形态学观察[D]. 聂茹霞.沈阳农业大学 2017
[2]两种中国原产百合体细胞胚发生发育的组织学初探[D]. 薛冰洋.沈阳农业大学 2017
[3]百合体胚发生过程中miR166及其靶基因的鉴定与表达分析[D]. 杨越.沈阳农业大学 2017
[4]基于体细胞胚发生的五种切花百合高效再生体系建立[D]. 严瑞.沈阳农业大学 2017
[5]百合体胚发生过程中miR171及其靶基因SCL6的鉴定与表达分析[D]. 贾娜娜.沈阳农业大学 2016
[6]Tae-miR9677前体及其小串联模拟靶标表达载体构建及小麦遗传转化研究[D]. 李赵杰.西北农林科技大学 2016
[7]白菜miR158的表达及其在花粉发育中的功能鉴定[D]. 马智明.浙江大学 2016
[8]野生百合高效再生体系建立及愈伤组织增殖调控研究[D]. 马怡迪.浙江大学 2015
[9]麝香百合胚性愈伤诱导及农杆菌介导的遗传转化体系的优化[D]. 张倩.华中农业大学 2013
[10]百合（Lilium）鳞茎薄层胚性愈伤组织诱导及再生植株遗传稳定性鉴定[D]. 陈龙.西北农林科技大学 2013
本文编号：3644978
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