西瓜鸟氨酸氨甲酰转移酶酶学特性及其基因克隆与表达研究
发布时间：2022-04-23 12:18
西瓜（Citrulluslanatus）是我国重要的经济作物和水果,富含各种营养成分。瓜氨酸作为西瓜的营养成分之一,是一种有效的氧自由基清除剂,在西瓜抗逆性代谢中发挥重要作用。而在人体中,瓜氨酸是参与尿素循环的中间代谢产物,有调节人体机能的作用。鸟氨酸氨甲酰转移酶（OCT）不仅是瓜氨酸合成代谢的关键酶,通过催化鸟氨酸和氨甲醜磷酸反应合成瓜氨酸和磷酸盐,而且参与了高等植物嘧啶与多胺的形成。对西瓜OCT的分离纯化有助于对该酶在西瓜瓜氨酸合成代谢及抗逆调控中作用的研究,从而为改良西瓜品种及选育新品种提供参考依据;而对西瓜OCT基因的克隆、表达及纯化,为研究OCT基因的功能及催化反应机理等研究奠定基础。本研究对西瓜OCT的提取条件进行了优化,利用热处理、盐析及透析法对西瓜OCT进行分离纯化,并对OCT的一些酶学特性进行了研究。同时利用分子生物学方法克隆并分析了西瓜OCT基因,构建了重组OCT蛋白原核表达载体,对其进行了表达、纯化、复性及活性分析。结果如下:1、西瓜OCT提取的最佳条件:Tris-HCl缓冲液pH值为8.5、料液比为1:5及提取时间为4 h;利用热处理、盐析及透析纯化所得该酶的纯...
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 西瓜的研究现状
1.1.1 西瓜的起源与分布
1.1.2 西瓜的营养与价值
1.1.3 西瓜的种植现状
1.2 西瓜瓜氨酸的研究现状
1.3 西瓜瓜氨酸合成中鸟氨酸氨甲酰转移酶的研究现状
1.3.1 鸟氨酸氨甲酰转移酶的分离提纯研究
1.3.2 鸟氨酸氨甲酰转移酶的酶促反应动力学研究
1.3.3 鸟氨酸氨甲酰转移酶的基因结构研究
1.3.4 鸟氨酸氨甲酰转移酶的分布定位研究
1.4 技术路线
1.5 目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验材料
2.1.2 酶与试剂盒
2.1.3 化学试剂与仪器设备
2.1.4 PCR引物设计
2.1.5 常用试剂配制
2.2 方法
2.2.1 西瓜OCT的提取及条件优化
2.2.2 西瓜OCT的分离纯化
2.2.3 西瓜OCT的酶学特性
2.2.4 西瓜叶片总RNA的提取
2.2.5 反转录合成cDNA
2.2.6 PCR扩增
2.2.7 PCR产物纯化
2.2.8 重组克隆载体的构建
2.2.9 生物信息学分析
2.2.10 重组pMD18-T-OCT质粒DNA的提取
2.2.11 开放阅读框的克隆
2.2.12 原核表达载体构建及鉴定
2.2.13 工程菌的表达
2.2.14 重组pET-30a-OCT蛋白诱导表达条件的优化
2.2.15 重组pET-30a-OCT包涵体蛋白的纯化及复性
2.2.16 重组pET-30a-OCT蛋白的质谱鉴定
3 结果与分析
3.1 西瓜OCT的提取及条件优化
3.1.1 不同缓冲液pH值对OCT活力的影响
3.1.2 不同料液比对OCT活力的影响
3.1.3 不同提取时间对OCT活力的影响
3.1.4 西瓜OCT提取条件的优化
3.2 西瓜OCT的分离纯化
3.2.1 蛋白标准曲线
3.2.2 热处理
3.2.3 盐析
3.2.4 透析
3.2.5 西瓜OCT的分离纯化
3.3 西瓜OCT的酶学特性
3.3.1 酶促反应的最适温度
3.3.2 酶促反应的最造pH值
3.3.3 酶促反应的K_m与V_(max)值的测定
3.3.4 金属离子及抑制剂对酶活力的影响
3.3.5 西瓜总RNA的提取
3.3.6 PCR扩增
3.3.7 生物信息学分析
3.3.8 重组表达载体pET-30a-OCT的双酶切鉴定
3.3.9 重组pET30a-OCT的诱导表达
3.3.10 重组pET-30a-OCT诱导表达条件的优化
3.3.11 重组pET-30a-OCT包涵体蛋白的纯化及复性
3.3.12 重组pET-30a-OCT的质谱鉴定
4 讨论
4.1 西瓜OCT的提取及条件优化
4.2 西瓜OCT的分离纯化
4.3 西瓜OCT的酶学特性
4.4 西瓜OCT蛋白的基因克隆与生物信息学分析
4.5 重组pET-30a-OCT的诱导表达
4.6 重组pET-30a-OCT诱导表达条件的优化
4.7 重组pET-30a-OCT包涵体蛋白的纯化及复性
4.8 重组pET-30a-OCT蛋白的质谱鉴定
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
附录
致谢
本文编号：3647163
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 西瓜的研究现状
1.1.1 西瓜的起源与分布
1.1.2 西瓜的营养与价值
1.1.3 西瓜的种植现状
1.2 西瓜瓜氨酸的研究现状
1.3 西瓜瓜氨酸合成中鸟氨酸氨甲酰转移酶的研究现状
1.3.1 鸟氨酸氨甲酰转移酶的分离提纯研究
1.3.2 鸟氨酸氨甲酰转移酶的酶促反应动力学研究
1.3.3 鸟氨酸氨甲酰转移酶的基因结构研究
1.3.4 鸟氨酸氨甲酰转移酶的分布定位研究
1.4 技术路线
1.5 目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验材料
2.1.2 酶与试剂盒
2.1.3 化学试剂与仪器设备
2.1.4 PCR引物设计
2.1.5 常用试剂配制
2.2 方法
2.2.1 西瓜OCT的提取及条件优化
2.2.2 西瓜OCT的分离纯化
2.2.3 西瓜OCT的酶学特性
2.2.4 西瓜叶片总RNA的提取
2.2.5 反转录合成cDNA
2.2.6 PCR扩增
2.2.7 PCR产物纯化
2.2.8 重组克隆载体的构建
2.2.9 生物信息学分析
2.2.10 重组pMD18-T-OCT质粒DNA的提取
2.2.11 开放阅读框的克隆
2.2.12 原核表达载体构建及鉴定
2.2.13 工程菌的表达
2.2.14 重组pET-30a-OCT蛋白诱导表达条件的优化
2.2.15 重组pET-30a-OCT包涵体蛋白的纯化及复性
2.2.16 重组pET-30a-OCT蛋白的质谱鉴定
3 结果与分析
3.1 西瓜OCT的提取及条件优化
3.1.1 不同缓冲液pH值对OCT活力的影响
3.1.2 不同料液比对OCT活力的影响
3.1.3 不同提取时间对OCT活力的影响
3.1.4 西瓜OCT提取条件的优化
3.2 西瓜OCT的分离纯化
3.2.1 蛋白标准曲线
3.2.2 热处理
3.2.3 盐析
3.2.4 透析
3.2.5 西瓜OCT的分离纯化
3.3 西瓜OCT的酶学特性
3.3.1 酶促反应的最适温度
3.3.2 酶促反应的最造pH值
3.3.3 酶促反应的K_m与V_(max)值的测定
3.3.4 金属离子及抑制剂对酶活力的影响
3.3.5 西瓜总RNA的提取
3.3.6 PCR扩增
3.3.7 生物信息学分析
3.3.8 重组表达载体pET-30a-OCT的双酶切鉴定
3.3.9 重组pET30a-OCT的诱导表达
3.3.10 重组pET-30a-OCT诱导表达条件的优化
3.3.11 重组pET-30a-OCT包涵体蛋白的纯化及复性
3.3.12 重组pET-30a-OCT的质谱鉴定
4 讨论
4.1 西瓜OCT的提取及条件优化
4.2 西瓜OCT的分离纯化
4.3 西瓜OCT的酶学特性
4.4 西瓜OCT蛋白的基因克隆与生物信息学分析
4.5 重组pET-30a-OCT的诱导表达
4.6 重组pET-30a-OCT诱导表达条件的优化
4.7 重组pET-30a-OCT包涵体蛋白的纯化及复性
4.8 重组pET-30a-OCT蛋白的质谱鉴定
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
附录
致谢
本文编号：3647163
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