转录激活因子CmICE1在露地菊‘火焰’中的抗寒功能分析

发布时间：2022-07-19 16:06

　　露地菊为菊科多年生草本植物,为东北地区主要园林花卉品种之一。品种繁多,具有一定的经济价值;管理粗放,具有一定的耐旱、耐寒、耐盐碱能力。大部分露地菊品种花期集中在9-10月份,在东北地区已进入秋季,气温较低,在一定程度上影响了露地菊的经济价值。因此,研究露地菊抗寒机理,提升现有露地菊品种的抗寒性,培育出抗寒能力更强的露地菊品种有着重要意义。本研究中,以露地菊’火焰’为主要试验材料,克隆得到植物抗寒ICE-CBF/DREB途径中的关键基因CmICE1、CmDREBa和CmDREBb,利用生物信息学相关软件对抗寒基因进行了分析;使用实时定量PCR的方法分析抗寒基因的表达模式;构建了带有安全标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301-PMI-CmICEI,利用农杆菌介导的叶盘侵染法转化露地菊’火焰’,获得了转基因植株并对转基因植株的抗寒性进行鉴定。得到结论如下:（1）克隆得到三个抗寒基因CmICE1、CmDREBa和CmDREBb,其中CmDREBa和CmDREBb是CmICE1的下游基因;CmICE1基因CDS区全长1410bp,编码470个氨基酸;CmDREBa基因CDS区全长579 b... 

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 露地菊的由来及应用
    1.2 植物抗寒生理的研究进展
        1.2.1 丙二醛、脯氨酸含量与植物抗寒性的关系
        1.2.2 酶系统与植物抗寒性间的关系
        1.2.3 相对电导率与植物抗寒性间的关系
    1.3 植物抗寒分子机制的研究进展
        1.3.1 植物寒信号响应的研究进展
        1.3.2 植物抗寒信号转导途径的研究进展
        1.3.3 ICE基因的研究进展
    1.4 转基因技术中安全标记基因的研究
        1.4.1 可视化的安全标记基因
        1.4.2 糖代谢相关的安全标记基因
        1.4.3 其它安全标记基因
    1.5 本研究的目的及意义
2 露地菊抗寒基因的克隆
    2.1 试验材料
    2.2 试验试剂
    2.3 试验方法
        2.3.1 露地菊总RNA的提取
        2.3.2 露地菊总RNA的电泳检测
        2.3.3 反转录合成cDNA
        2.3.4 PCR扩增
        2.3.5 PCR产物的回收纯化
        2.3.6 PCR产物与载体的连接与转化
        2.3.7 阳性克隆的挑取、检测与测序
        2.3.8 抗寒基因的生物信息学分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 露地菊总RNA的提取
        2.4.2 抗寒基因全长的PCR扩增及序列测定
        2.4.3 抗寒基因的生物信息学分析
    2.5 讨论
    2.6 本章小结
3 露地菊抗寒基因的表达分析
    3.1 试验材料
    3.2 试验试剂
    3.3 试验方法
        3.3.1 露地菊不同组织部位样品的采集
        3.3.2 露地菊光周期测定样品的采集
        3.3.3 露地菊的4℃处理方法及样品的采集
        3.3.4 露地菊总RNA的提取及电泳检测
        3.3.5 总RNA反转录为cDNA
        3.3.6 实时定量PCR
    3.4 结果与分析
        3.4.1 抗寒基因的组织特异性表达
        3.4.2 抗寒基因的光周期性表达
        3.4.3 抗寒基因4℃处理下的表达
    3.5 讨论
    3.6 本章小结
4 CmICE1载体构建及遗传转化露地菊'火焰'
    4.1 试验材料
    4.2 试验试剂
    4.3 试验方法
        4.3.1 引物设计
        4.3.2 利用attB-CmICE1-F/R引物进行第一次PCR
        4.3.3 利用attB-adapter-F/R引物进行第二次PCR
        4.3.4 BP反应
        4.3.5 LR反应
        4.3.6 三亲杂交法转化农杆菌
        4.3.7 培养基的配制
        4.3.8 预培养
        4.3.9 菌液侵染与共培养
        4.3.10 甘露糖筛选培养
        4.3.11 不定芽的生根培养
    4.4 结果与分析
        4.4.1 目的基因的两次PCR
        4.4.2 BP反应菌液PCR及测序检测
        4.4.3 LR反应菌液PCR及测序检测
        4.4.4 三亲杂交法转化农杆菌
        4.4.5 露地菊'火焰'遗传转化
    4.5 讨论
    4.6 本章小结
5 抗性植株的分子检测及表型观察
    5.1 露地菊抗性植株的PCR检测
        5.1.1 试验材料
        5.1.2 试验试剂
        5.1.3 试验方法
        5.1.4 结果与分析
    5.2 转基因植株相关基因表达量分析
        5.2.1 试验材料
        5.2.2 试验试剂
        5.2.3 试验方法
        5.2.4 结果与分析
    5.3 转基因植株寒处理下相关基因表达量分析
        5.3.1 试验材料
        5.3.2 试验试剂
        5.3.3 试验方法
        5.3.4 结果与分析
    5.4 转基因植株的表型观察
        5.4.1 试验材料
        5.4.2 试验试剂
        5.4.3 试验方法
        5.4.4 结果与分析
    5.5 讨论
    5.6 本章小结
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
[1]类受体激酶CRPK1调控拟南芥低温应答的分子机制研究[D]. 刘子妍.中国农业大学 2017

硕士论文
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[2]滨藜属四种植物抗旱性生理生化指标研究[D]. 李健.甘肃农业大学 2006
[3]露地栽培菊新品种的选育[D]. 何淼.东北林业大学 2001
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本文编号：3663726