金针菇子实体发育相关基因的功能研究

发布时间：2022-07-27 12:41

　　金针菇富含丰富的氨基酸、蛋白质和维生素等营养物质,是深受广大消费者欢迎的食用菌之一,拥有广阔的消费市场和开发前景。金针菇属于低温结实菌类,其子实体的发育需要经过低温诱导。金针菇的这一特点增加了金针菇工厂化栽培的能耗,因此,开展对金针菇子实体生长发育机理的研究,揭示金针菇子实体发育过程中的关键基因,对于定向改造金针菇基因组,培育高温型的金针菇菌株具有重要的科学意义和应用价值。本研究通过对金针菇在菌丝营养生长阶段和低温诱导下原基发育阶段的转录组进行测序分析,结合已有关于金针菇生长发育相关的研究报道,选择特殊转录因子以及子实体发育过程中重要信号传导途径中的差异表达基因为目标基因,借助最新的基因组编辑工具CRISPR/Cas9系统,通过构建基因敲除表达载体,转化金针菇原生质体,以期能探究这些差异表达基因在金针菇子实体发育过程中的具体作用功能。主要研究结果如下:1.以金针菇Fv-Yx菌株菌丝和原基转录组数据分析为依据,从大量的差异表达基因库中筛选出转录因子Mads8基因、c AMP传导途径基因N1477和双组分信号传导重要激酶基因HK535共3个差异表达基因,通过设计特异性引物,从金针菇Fv-Y... 

【文章页数】：91 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩略词及中文介绍
1. 前言
    1.1 金针菇的研究进展
        1.1.1 金针菇生长发育的营养条件
        1.1.2 金针菇生长发育环境条件
        1.1.3 金针菇生长发育机理研究进展
        1.1.4 真菌的双组份系统
        1.1.5 真菌的cAMP信号转导途径
    1.2 MADS-box的研究进展
        1.2.1 MADS-box的结构和分类
        1.2.2 MADS-box的生物学功能
    1.3 CRISPR/Cas的研究进展
        1.3.1 CRISPR/Cas系统的发现历程
        1.3.2 CRISPR/Cas系统的结构和分类
        1.3.3 CRISPR/Cas9系统的作用机理
        1.3.4 CRISPR/Cas9系统的应用
        1.3.5 CRISPR/Cas系统的优点和存在的问题
            1.3.5.1 CRISPR/Cas系统的优点
            1.3.5.2 CRISPR/Cas9系统的不足
            1.3.5.3 CRISPR/Cas9系统的改进方法
    1.4 本研究的目的和意义
    1.5 本研究的技术路线
2. 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 质粒和菌株
        2.1.2 实验仪器和设备
        2.1.3 培养基和和试剂的配制
        2.1.4 引物
        2.1.5 工具酶
        2.1.6 试剂盒
    2.2 方法
        2.2.1 转录组原材料的收集和测序
        2.2.2 菌丝和原基转录组数据的分析、差异表达文库的构建和基因的筛选
        2.2.3 金针菇Fv-Yx单核体的筛选和出菇实验
            2.2.3.1 金针菇原生质体的制备与再生
            2.2.3.2 单菌落的挑取与镜检
            2.2.3.3 单核体的出菇验证试验
        2.2.4 金针菇单核体菌丝和原生质体对潮霉素的浓度敏感实验
            2.2.4.1 金针菇单核体菌丝对潮霉素（HmB）的最低敏感浓度检测
            2.2.4.2 金针菇单核体原生质体对潮霉素（HmB）的最低敏感浓度检测
        2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
            2.2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
            2.2.5.2 大肠杆菌感受态细胞的鉴定
            2.2.5.3 大肠杆菌感受态细胞的转化
            2.2.5.4 大肠杆菌质粒的提取
        2.2.6 金针菇菌丝和原基差异表达基因基因的克隆
            2.2.6.1 金针菇RNA的提取和反转录cDNA的合成
            2.2.6.2 差异表达基因的克隆
            2.2.6.3 PCR产物检测
            2.2.6.4 PCR产物纯化
            2.2.6.5 PCR产物的测序
        2.2.7 Mads8、N1477、HK535基因gRNA载体的构建
            2.2.7.1 启动子H1片段（249 bp）的克隆
            2.2.7.2 gRNA片段（118 bp）的克隆
            2.2.7.3 潮霉素完整表达框（2227 bp）的克隆
            2.2.7.4 降落重叠衍伸PCR片段融合
            2.2.7.5 gRNA表达框架与pMD18-T载体连接
        2.2.8 Mads8和HK535重组载体的构建
            2.2.8.1 gRNA表达框的PCR克隆
            2.2.8.2 gRNA表达框和载体酶切
            2.2.8.3 gRNA表达框和载体片段的连接
            2.2.8.4 载体的PCR鉴定和酶切鉴定
        2.2.9 PEG介导的金针菇原生质体转化
        2.2.10 拟转化子的筛选与鉴定
            2.2.10.1 拟转化子基因组DNA的提取
            2.2.10.2 拟转化子的PCR鉴定和T7核酸内切酶
3. 结果与分析
    3.1 金针菇转录组材料的收集和测序结果分析
        3.1.1 金针菇转录组材料的收集
        3.1.2 转录组数据的分析
    3.2 差异表达基因转录组数据库比对结果
    3.3 金针菇单核体出菇实验
    3.4 金针菇单核体Fy74对潮霉素浓度的敏感性测定
        3.4.1 Fy74菌丝对潮霉素浓度的敏感性实验
        3.4.2 金针菇单核体Fy74原生质体对潮霉素浓度的敏感性实验
    3.5 差异基因gRNA载体的构建
        3.5.1 金针菇单核体Fy74总RNA的提取和cDNA合成
        3.5.2 pgRNA-Mads8载体的构建
            3.5.2.1 Mads8基因的克隆
            3.5.2.2 Mads8基因靶位点序列的选取和gRNA载体片段的克隆
            3.5.2.3 Mads8基因gRNA载体片段的融合
        3.5.3 pgRNA-N1477载体的构建
            3.5.3.1 N1477基因的克隆
            3.5.3.2 N1477基因靶位点序列的选取和gRNA载体片段的克隆
            3.5.3.3 N1477基因gRNA载体片段的融合
        3.5.4 pgRNA-HK535载体的构建
            3.5.4.1 HK535基因靶位点序列的选取和gRNA载体片段的克隆
            3.5.4.2 HK535基因gRNA载体片段的融合
    3.6 重组载体的构建
        3.6.1 H1-gRNA-hph片段的克隆
        3.6.2 重组载体的PCR鉴定和酶切鉴定
    3.7 PEG介导的金针菇原生质体转化
        3.7.1 PEG介导的金针菇原生质体共转化
        3.7.2 PEG介导的金针菇原生质体单转化
    3.8 拟转化子的筛选和鉴定
        3.8.1 拟转化子的筛选
        3.8.2 拟转化子基因组DNA的提取
        3.8.3 双质粒共转化拟转化子的鉴定
        3.8.4 重组质粒单转化拟转化子的鉴定
4. 讨论与结论
    4.1 讨论
        4.1.1 金针菇CRISPR/Cas9系统构建载体的策略
        4.1.2 CRISPR/Cas9基因敲除效率探讨
        4.1.3 单核体制备和PEG介导的金针菇原生质体转化效率的影响因素
        4.1.4 筛选标记基因的选择
    4.2 全文结论
    4.3 本研究的创新之处
致谢
参考文献
附录



本文编号：3665479