葡萄风信子MaFLS基因启动子的克隆及功能研究

发布时间：2022-10-03 17:01

　　葡萄风信子（Muscari spp.）是一种多年生单子叶球根观赏植物,花色以不同程度的蓝色为主、还有粉色、白色品种,因其具备简单的花色遗传背景,是研究单子叶植物花色育种的好材料。课题组前期研究表明葡萄风信子花色形成主要与类黄酮化合物有关,并提出假说:黄酮醇合成酶（Ma FLS）通过与二氢黄酮醇-4-还原酶（Ma DFR）竞争同一底物二氢黄酮醇从而通向黄酮醇和花青素两个支路,二者共同参与调控蓝、白葡萄风信子花色的形成。目前对蓝、白葡萄风信子花色相关的关键基因的克隆及功能验证已有研究,但在转录调控方面如何调控花色形成机理尚不明确。本研究以蓝色葡萄风信子‘黑眼睛’（M.aucheri‘Dark Eyes’）和白色葡萄风信子‘白丽人’（M.aucheri‘White Beauty’）为材料,针对黄酮醇支路上重要催化剂FLS基因及其启动子进行克隆及功能研究,主要取得以下研究结果:1.从葡萄风信子‘黑眼睛’中克隆得到一条新的FLS基因,命名为Ma FLS1。Ma FLS1基因编码区全长999 bp,编码332个氨基酸,登录号MT198683,蛋白分子量为36.96k Da,不稳定系数为40.68,... 

【文章页数】：87 页

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 葡萄风信子研究概述
    1.2 植物启动子研究概述
        1.2.1 植物启动子的分类
        1.2.2 植物启动子的结构
    1.3 植物启动子的克隆方法介绍
        1.3.1 利用启动子探针质粒载体筛选启动子
        1.3.2 PCR技术克隆启动子
    1.4 植物启动子的功能研究方法
        1.4.1 启动子生物信息学分析
        1.4.2 启动子关键元件鉴定
        1.4.3 启动子功能分析
    1.5 黄酮醇研究概述
        1.5.1 类黄酮及黄酮醇代谢途径
        1.5.2 黄酮醇合成酶(FLS)基因研究进展
        1.5.3 FLS基因启动子研究进展
    1.6 农杆菌介导的烟草转化研究概述
        1.6.1 农杆菌介导的瞬时转化烟草
        1.6.2 农杆菌介导的稳定转化烟草
    1.7 本研究的目的意义
    1.8 本研究主要内容及技术路线
        1.8.1 本研究主要内容
        1.8.2 本研究技术路线
第二章 葡萄风信子MaFLS基因的克隆及基本功能分析
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 植物实验材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 克隆菌株及载体
        2.1.5 序列分析所用软件和网站
    2.2 实验方法
        2.2.1 引物设计
        2.2.2 葡萄风信子总RNA的提取
        2.2.3 反转录First-Strand c DNA的合成
        2.2.4 葡萄风信子MaFLS1基因的克隆
        2.2.5 葡萄风信子MaFLS1基因克隆载体的构建
        2.2.6 葡萄风信子MaFLS1基因生物信息学分析
        2.2.7 葡萄风信子MaFLS1基因时空表达模式分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 葡萄风信子MaFLS1基因的克隆分析
        2.3.2 MaFLS1基因生物信息学分析
        2.3.3 葡萄风信子MaFLS1基因编码氨基酸同源性分析及聚类分析
        2.3.4 葡萄风信子MaFLS1基因表达分析
    2.4 讨论
第三章 MaFLS基因启动子克隆及活性分析
    3.1 材料与试剂
        3.1.1 植物实验材料
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 菌株及载体
        3.1.4 生物信息学分析所用软件和网站
    3.2 实验方法
        3.2.1 引物合成及测序
        3.2.2 蓝、白葡萄风信子基因组DNA的提取
        3.2.3 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子的克隆
        3.2.4 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子克隆载体构建
        3.2.5 启动子测序及生物信息学分析
        3.2.6 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子及缺失片段瞬时表达载体的构建
        3.2.7 冻融法转化农杆菌感受态
        3.2.8 瞬时转化本氏烟草
        3.2.9 GUS组织化学染色
    3.3 结果与分析
        3.3.1 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子的克隆分析
        3.3.2 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子生物信息学分析
        3.3.3 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子序列比对分析
        3.3.4 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子瞬时表达载体构建
        3.3.5 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子转化农杆菌鉴定
        3.3.6 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子活性分析
    3.4 讨论
第四章 MaFLS基因启动子在异源植物烟草中的功能分析
    4.1 材料与试剂
        4.1.1 植物实验材料
        4.1.2 实验所用载体
        4.1.3 实验试剂和菌株
    4.2 实验方法
        4.2.1 引物设计
        4.2.2 p HFLS、p BFLS启动子GUS融合稳定转化载体构建
        4.2.3 冻融法转化农杆菌
        4.2.4 农杆菌介导的烟草遗传转化
        4.2.5 转基因植株鉴定
        4.2.6 GUS组织化学染色
    4.3 结果与分析
        4.3.1 蓝、白葡萄风信子MaFLS基因启动子植物表达载体的构建
        4.3.2 植物表达载体转化农杆菌鉴定
        4.3.3 转基因植株的鉴定
        4.3.4 GUS组织化学染色及启动子特异性分析
    4.4 讨论
第五章 结论
参考文献
附录A 缩略词
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]白三叶CHS基因的过表达提高烟草类黄酮的含量[J]. 吴榕,田再民,郑国华,吴华圃,吴艳玲,牛艳芳.  草业科学. 2020(02)
[2]pOsHistone3启动子在烟草中的表达特性分析[J]. 胡明瑜,白文钦,潘晓雪,吴红,雷开荣.  南方农业. 2019(34)
[3]葡萄风信子MaGT1基因的克隆及其表达分析[J]. 梁沛雯,娄倩,刘雅莉.  西北植物学报. 2019(06)
[4]烟草中稳定遗传转化的新技术[J]. 杨丽萍,王悦,徐亚男.  吉林师范大学学报(自然科学版). 2019(02)
[5]植物组织特异性启动子研究进展[J]. 焦勇,柳小庆,江海洋,陈茹梅.  中国农业科技导报. 2019(01)
[6]启动子结构、功能预测和验证方法的研究进展[J]. 曾晓玲,赵昶灵,文国松,丁灿,张洪玲,徐率,古朝山.  分子植物育种. 2018(12)
[7]诱导型启动子在植物基因工程中的研究进展[J]. 杨瑞娟,白建荣,李锐,常利芳.  山西农业科学. 2018(02)
[8]植物生长调节剂在园艺作物上的应用[J]. 孙港,翟玉莹,周梦,杨月.  现代园艺. 2018(03)
[9]黑果枸杞及其白色果实F3′5′H基因启动子克隆及活性分析[J]. 祁银燕,陈雪妍,陈武生,邓磊,朱春云.  河北农业大学学报. 2017(06)
[10]葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2启动子的克隆与活性分析[J]. 余义和,张会灵,郭大龙,李秀珍,杨英军,李桂荣,李学强,张国海.  分子植物育种. 2017(06)

博士论文
[1]蓝色花葡萄风信子关键基因DFR和FLS调控花青苷积累的功能研究[D]. 刘红利.西北农林科技大学 2019
[2]葡萄风信子MYB和bHLH转录因子对花青苷合成的调控研究[D]. 陈凯利.西北农林科技大学 2017
[3]大豆、小麦抗逆相关Gm/TaAREB转录因子基因、启动子克隆及功能鉴定[D]. 高世庆.中国农业科学院 2007
[4]水稻（Oryza sativa L. ssp japonica）成熟与萌发花粉的蛋白质组学研究[D]. 戴绍军.中国科学院研究生院（植物研究所） 2006

硕士论文
[1]用于棉花抗黄萎病育种的根系特异性启动子的克隆与应用[D]. 陈亚东.浙江大学 2019
[2]苎麻韧皮部特异型启动子发掘及功能研究[D]. 郑焱诚.华中农业大学 2019
[3]烟草MYC1a/1b转录因子在烟碱合成中的功能分析[D]. 李斐.河南农业大学 2018
[4]苹果MdHB1基因启动子的克隆及特征分析[D]. 王豪杰.西北农林科技大学 2017
[5]利用酵母单杂交方法对OsHsfB2c启动子结合蛋白的筛选[D]. 李濯雪.湖南农业大学 2015
[6]巴斯德毕赤酵母新启动子PGCW14的调控结构和应用研究[D]. 张轩薇.华南理工大学 2013



本文编号：3684466