岷江百合GPAT基因启动子的克隆与功能初步分析
发布时间：2022-10-09 17:48
启动子对研究基因功能和植物生长发育的调控具有重要价值。组成型表达的启动子,如CaMV35S启动子,因其能促进外源基因在转基因植物中的表达,现被广泛应用于植物基因功能研究。虽然它可以驱动外源基因在宿主中高度表达,但由于其组成型表达的特点,它也会在宿主植物整个生长发育过程中的各个时期和各个组织中高度表达,从而过量表达目的基因,对植物的生长发育造成阻碍。组织特异性表达启动子和诱导型启动子可以克服这些缺点,它们可以在特定组织或特殊诱导条件下表达,植物外源基因的表达可被精确地控制,避免了目标基因过量表达对于植物造成的不良影响。百合在观赏方面具有重要的价值,但它易受不良环境（如低温,干旱,病害等）的影响。因此研究百合抗寒相关基因甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）基因的启动子对百合及其它植物的抗逆分子育种具有重要的价值。本研究以抗寒品种岷江百合为实验材料,应用染色体步移的技术,对岷江百合GPAT基因启动子进行克隆,并对其功能进行了初步研究。主要的实验结果如下：1.根据岷江百合GPAT基因编码区序列设计引物,以岷江百合基因组DNA为模板,利用染色体步移技术,用了接头PCR和FPNI-PCR的两种方法...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
第一章 文献综述
1.1 植物抗寒基因GPAT
1.1.1 GPAT基因应答机制
1.1.2 GPAT基因研究进展
1.2 植物启动子
1.2.1 启动子概述
1.2.1.1 启动子基本特征
1.2.2 启动子类型
1.2.2.1 组成型启动子
1.2.2.2 组织特异性启动子
1.2.2.3 诱导型启动子
1.2.3 启动子克隆方法
1.2.4 启动子功能研究方法
1.3 百合抗寒的研究进展
1.4 本试验的目的及意义
1.5 研究技术路线
第二章 岷江百合GPAT基因启动子的克隆及结构预测
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株与克隆载体
2.1.3 实验试剂
2.1.4 实验仪器及常用生物学软件
2.1.5 培养基及常用试剂的配置方法
2.2 实验方法
2.2.1 民江百合的组培
2.2.2 民江百合基因组DNA的提取
2.2.3 染色体步移法扩增GPAT基因启动子序列
2.2.3.1 接头PCR法克隆启动子序列
2.2.3.2 FPNI-PCR法克隆启动子序列
2.2.4 GPAT基因5'调控序列的测定
2.2.4.1 PCR产物的回收
2.2.4.2 回收的目的DNA片段与pGM-T的连接
2.2.4.3 连接产物的的转化和蓝白斑筛选
2.2.4.4 阳性克隆的PCR鉴定及测序
2.3 结果与分析
2.3.1 岷江百合的组培
2.3.2 岷江百合基因组DNA的提取
2.3.3 染色体步移法扩增GPAT基因启动子序列
2.3.3.1 第一次接头PCR扩增
2.3.3.2 第二次接头PCR法扩增
2.3.3.3 第一次FPNI-PCR法扩增
2.3.3.4 第二次FPNI-PCR扩增
2.3.4 接头PCR与FPNI-PCR扩增启动子比较
2.3.5 GPAT基因启动子的结构分析
2.4 讨论
第三章 岷江百合GPAT基因启动子缺失表达载体的构建
3.1 实验材料
3.1.1 菌株与质粒
3.1.2 实验试剂
3.1.3 主要仪器及生物软件
3.2 实验方法
3.2.1 GPAT基因启动子5’端缺失片段的克隆
3.2.2 重组表达载体的构建
3.2.2.1 GPAT启动子缺失片段中间载体的构建
3.2.2.2 GPAT启动子缺失体和pCAMBIA 1304的质粒提取
3.2.2.3 GPAT启动子缺失体质粒和载体pCAMBIA 1304质粒的酶切处理
3.2.2.4 重组表达载体质粒的构建
3.3 结果与分析
3.3.1 GPAT基因启动子5’端缺失体的克隆
3.3.2 缺失体重组质粒和pCAMBIA1304植物表达载体的双酶切
3.3.3 GFP/GUS融合表达载体的构建及检测
3.4 讨论
第四章 GPAT基因启动子的瞬时表达分析及烟草转化植株的获得和鉴定
4.1 实验材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 菌株与表达载体
4.1.3 实验试剂
4.1.4 主要仪器及常用生物软件
4.2 实验方法
4.2.1 烟草组培苗的培养
4.2.2 农杆菌介导转化烟草
4.2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备和农杆菌的转化
4.2.2.2 重组农杆菌的鉴定
4.2.3 组织化学染色
4.3 结果与分析
4.3.1 植物表达载体pCAMBIA1304-GPATp导入农杆菌的验证
4.3.2 GUS报告基因瞬时表达检测启动子的活性
4.4 烟草转化植株的获得
4.4.1 烟草的转化
4.4.2 烟草转化植株的检测
4.4.2.1 烟草转化植株的DNA提取
4.4.2.2 PCR检测
4.4.3 结果与分析
4.4.3.1 烟草的转化
4.4.3.2 PCR验证烟草转化植株
4.5 讨论
第五章 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]拟南芥叶片和角果特异性启动子的筛选与分析[J]. 郭燕,詹高淼,杨晓燕,华玮,吕应堂. 中国油料作物学报. 2015(01)
[2]植物启动子研究进展[J]. 李田,孙景宽,刘京涛. 生物技术通报. 2015(02)
[3]SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用[J]. 孙炳剑,陈清清,袁虹霞,施艳,李洪连. 中国农业科学. 2015(01)
[4]低温胁迫对不同百合主要生理指标的影响[J]. 王玲丽,贾文杰,马璐琳,崔光芬,吴丽芳,王祥宁,段青,蒋亚莲,王继华. 植物生理学报. 2014(09)
[5]一个新水稻根尖特异表达启动子的分离与鉴定[J]. 赵红玉,徐磊,魏溪涓,邓敏娟,王芳,易可可. 中国水稻科学. 2014(04)
[6]组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展[J]. 贺红霞,陈亮,林春晶,柳青. 中国农学通报. 2014(09)
[7]低温胁迫下草菇甘油‐3‐磷酸酰基转移酶基因表达变化的研究[J]. 姜威,赵妍,汪虹,冯爱萍,陈明杰. 菌物学报. 2014(02)
[8]植物GPATs基因研究进展[J]. 刘聪,肖旦望,施春霖,胡学芳,邬克彬,官春云,熊兴华. 遗传. 2013(12)
[9]甜瓜CmACOⅠ启动子组织特异性表达研究[J]. 毛娟,陆璐,陈佰鸿,禇明宇,赵长增. 园艺学报. 2013(06)
[10]蓖麻GPAT基因SNPs及与油脂含量的关联分析[J]. 徐宸敏,邱旭,刘小烛. 绵阳师范学院学报. 2012(05)
博士论文
[1]野生百合卷丹（Lilium lancifolium）响应低温信号的分子机制研究[D]. 王晶懋.北京林业大学 2015
[2]落叶松体细胞胚TCTP与NFYA基因克隆及其在ABA调控过程中的表达机制[D]. 张立峰.中国林业科学研究院 2014
[3]温度胁迫下番茄叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的功能分析[D]. 隋娜.山东农业大学 2007
硕士论文
[1]甘蓝型油菜GPAT6基因的克隆与功能分析[D]. 刘聪.湖南农业大学 2014
[2]巴斯德毕赤酵母新启动子PGCW14的调控结构和应用研究[D]. 张轩薇.华南理工大学 2013
本文编号：3689083
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
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中文摘要
英文摘要
第一章 文献综述
1.1 植物抗寒基因GPAT
1.1.1 GPAT基因应答机制
1.1.2 GPAT基因研究进展
1.2 植物启动子
1.2.1 启动子概述
1.2.1.1 启动子基本特征
1.2.2 启动子类型
1.2.2.1 组成型启动子
1.2.2.2 组织特异性启动子
1.2.2.3 诱导型启动子
1.2.3 启动子克隆方法
1.2.4 启动子功能研究方法
1.3 百合抗寒的研究进展
1.4 本试验的目的及意义
1.5 研究技术路线
第二章 岷江百合GPAT基因启动子的克隆及结构预测
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株与克隆载体
2.1.3 实验试剂
2.1.4 实验仪器及常用生物学软件
2.1.5 培养基及常用试剂的配置方法
2.2 实验方法
2.2.1 民江百合的组培
2.2.2 民江百合基因组DNA的提取
2.2.3 染色体步移法扩增GPAT基因启动子序列
2.2.3.1 接头PCR法克隆启动子序列
2.2.3.2 FPNI-PCR法克隆启动子序列
2.2.4 GPAT基因5'调控序列的测定
2.2.4.1 PCR产物的回收
2.2.4.2 回收的目的DNA片段与pGM-T的连接
2.2.4.3 连接产物的的转化和蓝白斑筛选
2.2.4.4 阳性克隆的PCR鉴定及测序
2.3 结果与分析
2.3.1 岷江百合的组培
2.3.2 岷江百合基因组DNA的提取
2.3.3 染色体步移法扩增GPAT基因启动子序列
2.3.3.1 第一次接头PCR扩增
2.3.3.2 第二次接头PCR法扩增
2.3.3.3 第一次FPNI-PCR法扩增
2.3.3.4 第二次FPNI-PCR扩增
2.3.4 接头PCR与FPNI-PCR扩增启动子比较
2.3.5 GPAT基因启动子的结构分析
2.4 讨论
第三章 岷江百合GPAT基因启动子缺失表达载体的构建
3.1 实验材料
3.1.1 菌株与质粒
3.1.2 实验试剂
3.1.3 主要仪器及生物软件
3.2 实验方法
3.2.1 GPAT基因启动子5’端缺失片段的克隆
3.2.2 重组表达载体的构建
3.2.2.1 GPAT启动子缺失片段中间载体的构建
3.2.2.2 GPAT启动子缺失体和pCAMBIA 1304的质粒提取
3.2.2.3 GPAT启动子缺失体质粒和载体pCAMBIA 1304质粒的酶切处理
3.2.2.4 重组表达载体质粒的构建
3.3 结果与分析
3.3.1 GPAT基因启动子5’端缺失体的克隆
3.3.2 缺失体重组质粒和pCAMBIA1304植物表达载体的双酶切
3.3.3 GFP/GUS融合表达载体的构建及检测
3.4 讨论
第四章 GPAT基因启动子的瞬时表达分析及烟草转化植株的获得和鉴定
4.1 实验材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 菌株与表达载体
4.1.3 实验试剂
4.1.4 主要仪器及常用生物软件
4.2 实验方法
4.2.1 烟草组培苗的培养
4.2.2 农杆菌介导转化烟草
4.2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备和农杆菌的转化
4.2.2.2 重组农杆菌的鉴定
4.2.3 组织化学染色
4.3 结果与分析
4.3.1 植物表达载体pCAMBIA1304-GPATp导入农杆菌的验证
4.3.2 GUS报告基因瞬时表达检测启动子的活性
4.4 烟草转化植株的获得
4.4.1 烟草的转化
4.4.2 烟草转化植株的检测
4.4.2.1 烟草转化植株的DNA提取
4.4.2.2 PCR检测
4.4.3 结果与分析
4.4.3.1 烟草的转化
4.4.3.2 PCR验证烟草转化植株
4.5 讨论
第五章 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]拟南芥叶片和角果特异性启动子的筛选与分析[J]. 郭燕,詹高淼,杨晓燕,华玮,吕应堂. 中国油料作物学报. 2015(01)
[2]植物启动子研究进展[J]. 李田,孙景宽,刘京涛. 生物技术通报. 2015(02)
[3]SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用[J]. 孙炳剑,陈清清,袁虹霞,施艳,李洪连. 中国农业科学. 2015(01)
[4]低温胁迫对不同百合主要生理指标的影响[J]. 王玲丽,贾文杰,马璐琳,崔光芬,吴丽芳,王祥宁,段青,蒋亚莲,王继华. 植物生理学报. 2014(09)
[5]一个新水稻根尖特异表达启动子的分离与鉴定[J]. 赵红玉,徐磊,魏溪涓,邓敏娟,王芳,易可可. 中国水稻科学. 2014(04)
[6]组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展[J]. 贺红霞,陈亮,林春晶,柳青. 中国农学通报. 2014(09)
[7]低温胁迫下草菇甘油‐3‐磷酸酰基转移酶基因表达变化的研究[J]. 姜威,赵妍,汪虹,冯爱萍,陈明杰. 菌物学报. 2014(02)
[8]植物GPATs基因研究进展[J]. 刘聪,肖旦望,施春霖,胡学芳,邬克彬,官春云,熊兴华. 遗传. 2013(12)
[9]甜瓜CmACOⅠ启动子组织特异性表达研究[J]. 毛娟,陆璐,陈佰鸿,禇明宇,赵长增. 园艺学报. 2013(06)
[10]蓖麻GPAT基因SNPs及与油脂含量的关联分析[J]. 徐宸敏,邱旭,刘小烛. 绵阳师范学院学报. 2012(05)
博士论文
[1]野生百合卷丹（Lilium lancifolium）响应低温信号的分子机制研究[D]. 王晶懋.北京林业大学 2015
[2]落叶松体细胞胚TCTP与NFYA基因克隆及其在ABA调控过程中的表达机制[D]. 张立峰.中国林业科学研究院 2014
[3]温度胁迫下番茄叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的功能分析[D]. 隋娜.山东农业大学 2007
硕士论文
[1]甘蓝型油菜GPAT6基因的克隆与功能分析[D]. 刘聪.湖南农业大学 2014
[2]巴斯德毕赤酵母新启动子PGCW14的调控结构和应用研究[D]. 张轩薇.华南理工大学 2013
本文编号：3689083
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