龙眼体胚发生过程中DlDCLs的克隆与功能分析

发布时间：2023-03-18 14:13

　　龙眼(Dimocarpus longanLour.)是无患子科(Sapindaceae)常绿木本果树,是我国南亚热带名贵特产,历史上有南方“桂圆”北“人参”之称。龙眼种子(胚胎)等发育情况与龙眼果实产量品质密切相关。越来越多证据表明植物体胚发生过程中基因表达的时空特异性不仅由特异的DNA序列控制,还受表观遗传调控,其中最重要的修饰之一就是DNA甲基化,一定程度的DNA甲基化有利于植物体胚的正常发育。近年的研究报道表明,miRNA,特别是24nt的1miRNA与DNA甲基化密切相关。然而,目前关于龙眼体胚发生过程中1miRNA介导靶基因甲基化机制研究较少,并且其合成途径中Dicer-like蛋白(DCL蛋白)在龙眼体胚发生中的功能特异性以及响应外界环境作用机制尚不明确。本课题组前期研究表明,miRNA在龙眼体胚发生中具有重要作用,而mmiRNA的产生依赖于DCL酶的切割,提示DCL在龙眼体胚中同样起着调控作用。鉴于此,本研究以龙眼胚性愈伤组织的转录组数据为基础,对龙眼胚性愈伤组织DlDCLs基因家族成员进行克隆和生物信息学分析;以龙眼基因组数据为参考,对DlDCLs进行启动子克隆和顺式作...

【文章页数】：126 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
缩写词
摘要
Abstact
第一章 引言
    1 植物DCL基因研究进展
        1.1 植物DCL的作用
        1.2 DCL与植物生长发育
        1.3 DCL与植物抗逆性
        1.4 DCL与植物激素代谢
    2 植物miRNA的研究进展
        2.1 植物miRNA及1miRNA的合成和作用机理
        2.2 miRNA在植物生长发育和应激反应中的作用
            2.2.1 miRNA参与植物生长发育
            2.2.2 miRNA植物生物和非生物胁迫
        2.3 miRNA与植物体胚发生
    3 DNA甲基化的研究进展
        3.1 DNA甲基化机制
        3.2 RNA介导的DNA甲基化
        3.3 DNA甲基化与植物体胚发生
    4 植物体细胞胚胎发生研究进展
        4.1 激素对植物体胚发生的影响
        4.2 植物体胚发生过程中的基因表达调控
    5 龙眼体细胞胚胎发生研究进展
    6 研究的意义及主要内容
        6.1 研究意义
        6.2 研究的主要内容
第二章 龙眼DlDCLs基因家族成员的克隆与生物信息学分析
    第一节 龙眼DlDCLs基因家族成员的克隆
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 龙眼总RNA提取及逆转录
                1.2.2 龙眼转录组数据分析及DlDCLs基因序列的获得
                1.2.3 龙眼DlDCLs基因家族成员的引物设计和克隆
                1.2.4 龙眼DlDCLs基因家族成员目的片段的回收和测序
                1.2.5 龙眼DlDCLs基因家族成员cDNA序列分析
        2 结果与分析
            2.1 龙眼转录组数据库DCL基因差异表达分析
            2.2 龙眼DlDCLs基因成员的克隆验证
                2.2.1 龙眼DlDCL1基因的克隆验证
                2.2.2 龙眼DlDCL2基因的克隆验证
                2.2.3 龙眼DlDCL3基因的克隆验证
                2.2.4 龙眼DlDCL4基因的克隆验证
            2.3 龙眼DlDCLs基因氨基酸序列分析及亲缘关系分析
        3 讨论
    第二节 龙眼DlDCLs基因家族成员的生物信息学分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 龙眼DlDCLs理化性质分析
            2.2 龙眼DlDCLs信号肽及亚细胞定位预测
            2.3 龙眼DlDCLs跨膜结构预测与分析
            2.4 龙眼DlDCLs卷螺旋预测与分析
            2.5 龙眼DlDCLs磷酸化位点预测
            2.6 龙眼DlDCLs蛋白结构域预测
            2.7 DCL系统进化树分析
        3 讨论
第三章 龙眼DlDCLs基因家族成员启动子的克隆与分析
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
            1.2.1 DNA提取
            1.2.2 龙眼DlDCLs基因家族成员启动子序列的获得和克隆
            1.2.3 生物信息学分析
    2 结果与分析
        2.1 龙眼DlDCLs基因家族成员启动子序列获得
        2.2 龙眼DlDCLs基因家族成员启动子顺式元件功能预测分析
            2.2.1 龙眼DlDCLs基因家族成员5'调控序列光反应元件分析
            2.2.2 龙眼DlDCLs基因家族成员5'调控序列激素响应元件分析
            2.2.3 龙眼DlDCLs基因家族成员5'调控序列逆境响应元件分析
            2.2.4 龙眼DlDCLs基因家族成员5'调控序列生长相关元件分析
            2.2.5 龙眼DlDCLs基因家族成员5'调控序列未知相关元件分析
        2.3 龙眼DlDCLs基因家族成员启动子CpG岛的预测
    3 讨论
第四章 龙眼DlDCLs表达模式分析
    第一节 DlDCLs在龙眼体胚和组织器官发生过程中表达分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 总RNA的提取和第一链cDNA的合成
                1.2.2 龙眼DCL基因qPCR引物设计和分析
        2 结果与分析
            2.1 DlDCLs在龙眼非胚性与胚性培养物中的表达模式分析
            2.2 DlDCLs在龙眼红核子不同组织器官中的表达模式分析
        3 讨论
            3.1 龙眼DlDCLs在非胚性愈伤组织和龙眼体胚发生过程中可能具有功能的交叉和互补
            3.2 龙眼DlDCLs可能参与叶片和花器官发育
    第二节 龙眼DlDCLs在激素和非生物胁迫处理下的表达分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.2.1 不同激素处理下龙眼胚性愈伤组织的获得
                1.2.2 不同非生物胁迫下龙眼胚性愈伤组织的获得
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 龙眼DlDCLs在不同激素处理下表达模式分析
                2.1.1 不同浓度生长素(2,4-D)处理下DlDCLs的表达模式分析
                2.1.2 不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)处理下DlDCLs的表达模式分析
                2.1.3 不同浓度水杨酸(SA)处理下DlDCLs的表达模式分析
                2.1.4 不同浓度赤霉素(GA3)处理下DlDCLs的表达模式分析
                2.1.5 不同浓度脱落酸(ABA)处理下DlDCLs的表达模式分析
                2.1.6 不同浓度乙烯(ETH)处理下DlDCLs的表达模式分析
            2.2 非生物胁迫处理下DlDCLs的表达模式分析
                2.2.1 不同光质处理下DlDCLs的表达模式分析
                2.2.2 不同浓度蔗糖处理下DlDCLs的表达模式分析
                2.2.3 不同温度处理下DlDCLs的表达模式分析
                2.2.4 盐胁迫处理下DlDCLs的表达模式分析
        3 讨论
            3.1 龙眼DlDCLs可能响应多种激素应答
            3.2 龙眼DlDCLs可能响应多种非生物胁迫的应答
第五章 5-氮胞苷(5-azaC)对龙眼胚性愈伤组织细胞和DlDCLs表达的影响
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
            1.2.1 不同浓度5-azaC的MS+2,4-D_1.0mg/L固体培养基配制
            1.2.2 不同浓度5-azaC的MS+2,4-D_1.0mg/L液体培养基配制
            1.2.3 龙眼胚性愈伤组织形态观察
            1.2.4 总RNA的提取和第一链cDNA的合成
    2 结果与分析
        2.1 5-azaC处理下龙眼愈伤组织生长量观察
        2.2 5-azaC处理下龙眼愈伤组织细胞形态观察
        2.3 5-氮胞苷(5-azaC)处理下DlDCLs基因表达模式分析
    3 讨论
        3.1 DNA甲基化影响龙眼胚性愈伤组织生长发育
        3.2 龙眼DlDCLs可能参与DNA甲基化过程
第六章 龙眼DlDCLs基因沉默对体胚发生早期的影响
    第一节 龙眼DlDCLs基因在体胚发生早期的时空表达
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 龙眼胚性愈伤组织悬浮材料的获得
                1.1.2 龙眼胚性愈伤组织早期体胚发生阶段材料的获得
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 龙眼体胚发生早期细胞分化观察
            2.2 龙眼体胚发生早期DIDCLs定量表达分析
        3 讨论
    第二节 DlDCL3和DlDCL4在龙眼体胚发生早期的功能验证
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 siRNA靶点筛选与qPCR检测
                1.2.2 DlDCLs基因抑制后对龙眼体胚早期细胞形态观察
        2 结果分析
            2.1 龙眼DlDCL3和DlDCL4基因siRNA抑制靶点筛选
            2.2 龙眼DlDCL3基因抑制后对龙眼体胚形态建成的影响
            2.3 龙眼DlDCL4基因抑制后对龙眼体胚形态建成的影响
        3 讨论
第七章 小结与展望
参考文献
附录
    附录1 龙眼DlDCLs基因cDNA序列信息
    附录2 龙眼DlDCLs基因启动子序列信息
在学硕期间发表论文、获奖及参加学术会议情况
致谢



本文编号：3763285