9个潜在的香蕉枯萎病菌致病相关基因表达分析及酰胺转移酶基因的敲除和功能分析
发布时间：2023-03-19 21:40
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的毁灭性的土传维管束香蕉真菌病害,已经对全球香蕉产业造成严重影响。由于香蕉抗性栽培品种的缺乏,以及对病原菌致病分子机理和香蕉抗性分子机制的不清楚等原因,目前还没有真正十分有效的防治方法。为了阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机理,为香蕉抗病品种培育提供方向及防治药物开发提供靶标,本文从香蕉枯萎病菌4号(Foc4)和1号小种(Foc1)的比较蛋白质组分析出发,选取了 9个在Foc1和Foc4中差异表达的潜在致病相关蛋白,进行了基因克隆,并运用荧光定量PCR方法进行基因表达分析。选取酰胺转移酶基因构建基因敲除载体,进行了基因敲除和基因功能验证。主要的研究结果如下:1.从尖孢镰刀菌1号小种和4号小种的比较蛋白质组学分析中选择9个差异蛋白,利用荧光定量PCR对基因表达量进行了分析,从中筛选出4个差异表达基因。2.扩增了酰胺转移酶的左右侧同源臂,并成功构建了带GFP(绿色荧光蛋白)标记敲除载体。3.利用PEG介导的原生质体转化法对Foc4菌株进行了基因敲除,获得了 10个带有GFP(绿色荧光蛋白)和HPH(潮霉素磷酸转移酶)标记的转化子。4.通过对转化子的各种验证试...
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 导论
1.1 香蕉简介
1.2 香蕉枯萎病与尖孢镰刀菌
1.2.1 香蕉枯萎病
1.2.2 尖孢镰刀菌
1.2.3 尖孢镰刀菌致病机理
1.2.4 香蕉枯萎病发病主要症状
1.2.5 香蕉枯萎病菌的生理小种与危害
1.2.6 香蕉抗病机理及目前的香蕉枯萎病病害的治理
1.3 香蕉枯萎病菌的致病分子机制
1.4 利用比较蛋白质组学寻找致病基因
1.5 尖孢镰刀菌的遗传转化
1.5.1 丝状真菌的几种主要转化方法
1.5.2 转化DNA与基因组的整合
1.6 本实验的研究目的与意义
1.7 技术路线
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 试剂盒
2.1.3 试剂及配液
2.1.4 培养基
2.1.5 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 前期蛋白质组实验数据整理
2.2.2 Foc1和Foc4的培养
2.2.3 香蕉的处理及采样
2.2.4 香蕉枯萎病菌RNA提取
2.2.5 反转录cDNA
2.2.6 基因全长克隆
2.2.7 基因表达分析——荧光定量PCR
2.2.8 香蕉枯萎病菌4号生理小种基因组DNA的提取
2.2.9 基因敲除载体的构建
2.2.10 原生质体的制备
2.2.11 PEG介导的原生质体转化
2.2.12 转化子基因敲除验证
2.2.13 敲除子的菌落形态观察
2.2.14 敲除子的玻璃纸穿透实验
2.2.15 敲除子的离体叶片实验
2.2.16 敲除子的苹果切片定殖实验
2.2.17 敲除子的过氧化氢耐受性实验
2.2.18 敲除子纤维素利用实验
2.2.19 敲除子渗透压胁迫实验
2.2.20 敲除子细胞壁选择性压力实验
2.2.21 敲除子致病性实验
3 结果与分析
3.1 目的基因克隆
3.2 基因表达分析
3.3 目的基因敲除载体的构建
3.3.1 同源臂的扩增
3.3.2 载体构建
3.3.3 基因敲除载体的酶切验证
3.4 原生质体的获得
3.5 敲除转化子的验证
3.5.1 潮霉素抗性筛选
3.5.2 转化子的共聚焦显微镜观察
3.5.3 转化子PCR验证
3.6 敲除子的表型及生物特性分析
3.6.1 菌落形态
3.6.2 玻璃纸穿透
3.6.3 苹果切片穿透试验
3.6.4 香蕉离体叶片试验
3.6.5 过氧化氢耐受试验
3.6.6 纤维素利用
3.6.7 渗透压胁迫试验
3.6.8 细胞壁选择性胁迫试验
3.7 致病力测定
4 讨论
4.1 基因表达分析
4.2 敲除载体的构建
4.3 原生质体的转化
4.4 转化子的检测与基因敲除
4.5 表型及致病性检测
5 结论
参考文献
致谢
本文编号：3766034
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 导论
1.1 香蕉简介
1.2 香蕉枯萎病与尖孢镰刀菌
1.2.1 香蕉枯萎病
1.2.2 尖孢镰刀菌
1.2.3 尖孢镰刀菌致病机理
1.2.4 香蕉枯萎病发病主要症状
1.2.5 香蕉枯萎病菌的生理小种与危害
1.2.6 香蕉抗病机理及目前的香蕉枯萎病病害的治理
1.3 香蕉枯萎病菌的致病分子机制
1.4 利用比较蛋白质组学寻找致病基因
1.5 尖孢镰刀菌的遗传转化
1.5.1 丝状真菌的几种主要转化方法
1.5.2 转化DNA与基因组的整合
1.6 本实验的研究目的与意义
1.7 技术路线
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 试剂盒
2.1.3 试剂及配液
2.1.4 培养基
2.1.5 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 前期蛋白质组实验数据整理
2.2.2 Foc1和Foc4的培养
2.2.3 香蕉的处理及采样
2.2.4 香蕉枯萎病菌RNA提取
2.2.5 反转录cDNA
2.2.6 基因全长克隆
2.2.7 基因表达分析——荧光定量PCR
2.2.8 香蕉枯萎病菌4号生理小种基因组DNA的提取
2.2.9 基因敲除载体的构建
2.2.10 原生质体的制备
2.2.11 PEG介导的原生质体转化
2.2.12 转化子基因敲除验证
2.2.13 敲除子的菌落形态观察
2.2.14 敲除子的玻璃纸穿透实验
2.2.15 敲除子的离体叶片实验
2.2.16 敲除子的苹果切片定殖实验
2.2.17 敲除子的过氧化氢耐受性实验
2.2.18 敲除子纤维素利用实验
2.2.19 敲除子渗透压胁迫实验
2.2.20 敲除子细胞壁选择性压力实验
2.2.21 敲除子致病性实验
3 结果与分析
3.1 目的基因克隆
3.2 基因表达分析
3.3 目的基因敲除载体的构建
3.3.1 同源臂的扩增
3.3.2 载体构建
3.3.3 基因敲除载体的酶切验证
3.4 原生质体的获得
3.5 敲除转化子的验证
3.5.1 潮霉素抗性筛选
3.5.2 转化子的共聚焦显微镜观察
3.5.3 转化子PCR验证
3.6 敲除子的表型及生物特性分析
3.6.1 菌落形态
3.6.2 玻璃纸穿透
3.6.3 苹果切片穿透试验
3.6.4 香蕉离体叶片试验
3.6.5 过氧化氢耐受试验
3.6.6 纤维素利用
3.6.7 渗透压胁迫试验
3.6.8 细胞壁选择性胁迫试验
3.7 致病力测定
4 讨论
4.1 基因表达分析
4.2 敲除载体的构建
4.3 原生质体的转化
4.4 转化子的检测与基因敲除
4.5 表型及致病性检测
5 结论
参考文献
致谢
本文编号：3766034
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/3766034.html
