CRISPR/Cas9技术的建立及其在君迁子上的初步应用

发布时间：2023-04-03 17:39

　　CRISPR/Cas9系统是近年来出现的一项新的生物技术,能够利用RNA介导基因编辑实现基因组的定向修饰,被逐渐应用于多种植物的基因组编辑研究,但迄今尚未在柿属植物中见到相关报道。柿果肉中原花青素的积累是其产生涩感的主要因素,原花青素的合成需要多种结构基因和调控基因协同完成,其中结构基因ANR通过将花青素转变为原花青素前体物质—表儿茶素,发挥了关键作用;类胡萝卜素是参与柿果及叶片等组织器官成色的重要色素,PDS基因在其生物合成过程中起关键作用,能够催化无色的八氢番茄红素转换为有色的类胡萝卜素。本研究利用CRISPR/Cas9技术分别对烟草Nt PDS基因和君迁子Dl ANR基因、Dl PDS基因进行定向敲除,首先通过已有报道构建含有两个靶点的双元表达载体,进而利用遗传转化实现内源基因的稳定变异,最终通过表型观察及测序检测编辑效果;进一步将建立的技术体系应用于柿属植物。主要研究结果如下:1.选用植物的基因编辑载体PHSE401-GFP和PRGEB32-Gh6.7S-Cas9,针对栽培型烟草的Nt PDS基因构建PHSE-2g R-Nt PDS、p RGEB-2g R-Nt PDS重组载体...

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
    1.1 课题的提出
    1.2 君迁子DlANR和 DlPDS的研究进展
        1.2.1 概述
        1.2.2 DlANR参与的柿单宁生物合成途径
        1.2.3 DlPDS参与的柿类胡萝卜素合成途径
    1.3 CRISPR/Cas系统的研究进展
        1.3.1 CRISPR/Cas9 系统的结构与作用机制
        1.3.2 CRISPR/Cas9 系统的改造升级
        1.3.3 CRISPR/Cas9 系统的应用
        1.3.4 其他CRISPR系统概述
    1.4 研究意义和内容
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株与载体
    2.2 试验方法
        2.2.1 DlPDS和 DlANR基因的鉴定及靶序列扩增
        2.2.2 敲除靶点设计
        2.2.3 sgRNA克隆框的扩增
            2.2.3.1 pCBC-2g RNA表达框的扩增
            2.2.3.2 pGTR4-2g RNA表达框的扩增
        2.2.4 双靶点CRISPR载体的构建
            2.2.4.1 pHSE-GFP-2g R敲除载体的构建
            2.2.4.2 pRGEB32-2g R敲除载体的构建
        2.2.5 重组载体转化农杆菌
        2.2.6 叶盘法转化烟草及君迁子
        2.2.7 再生苗DNA的提取及阳性鉴定
        2.2.8 DNA靶向片段的克隆与检测
3 结果与分析
    3.1 靶基因DlPDS和 DlANR的序列分析
    3.2 靶点的选定及引物设计结果
    3.3 CRISPR表达载体的构建分析
    3.4 烟草及君迁子稳定遗传株系的获得
    3.5 烟草转基因株系的编辑检测
    3.6 君迁子再生植株的基因敲除鉴定
4 讨论
    4.1 君迁子敲除基因DlPDS和 DlANR的功能及序列分析
    4.2 不同CRISPR/Cas9 载体转化烟草及君迁子的编辑效率分析
    4.3 遗传转化条件的优化
    4.4 问题与展望
参考文献
附录
简历及在学期间科研实践
致谢



本文编号：3780848