芍药种子下胚轴休眠与萌发相关调控基因PlGAI1的克隆及功能分析
发布时间：2023-06-08 21:00
芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科芍药属的多年生宿根草本花卉,其良好的观赏特点和极高的切花品质逐渐被世界上越来越多的人们赏识,市场需求极高。但芍药种子有上、下胚轴双重休眠的特性,其生长周期过长,在实际生产中有很大障碍,尤其是对新品种选育和杂交育种工作产生了巨大的影响。本研究以母本为芍药品种‘粉玉奴’,父本为芍药品种‘粉玉楼’的杂交种子为试验材料。选取沙藏0d(PDB,下胚轴萌发前)和沙藏40d(PDA,下胚轴萌发后的露白种子)的种子为试验材料,利用转录组学技术分析芍药种子下胚轴萌发前后的基因表达差异。找到差异表达基因中与下胚轴休眠与萌发相关的关键基因,并进行克隆及原核表达分析。试验中主要的结果如下：1.转录组测序共得到120181964条Unigene序列,从PDB种子的RNA中获得了58107876条Unigene序列,从PDA种子的RNA中获得了6274088条Unigene序列。序列经过滤后共获得107929718条clean reads。本研究采用de novo方法,对测序数据进行了拼接,共获得123577个contig,其中大于2kb的有1336...
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 芍药概述
1.2 芍药种子休眠的研究进展
1.3 种子休眠的激素调控机制
1.3.1 ABA在种子萌发过程中的作用
1.3.2 BR在种子萌发过程中的作用
1.3.3 乙烯在种子萌发过程中的作用
1.3.4 GA在种子萌发过程中的作用
1.4 DELLA蛋白的研究进展
1.4.1 DELLA蛋白的结构
1.4.2 DELLA蛋白的功能
1.5 RNA-Seq技术的研究进展
1.5.1 RNA-Seq技术的发展
1.5.2 RNA-Seq的优势
1.5.3 RNA-Seq研究基因的差异表达
1.6 本研究的目的意义及技术路线
1.6.1 本研究的目的意义
1.6.2 本研究的内容和技术路线
第二章 芍药种子下胚轴萌发前后转录组样品的测序
2.1 试验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 测序材料准备
2.1.3 试验仪器与试剂
2.2 试验方法
2.2.1 操作前有关器皿及药品的处理
2.2.2 芍药种子总RNA的提取
2.2.3 总RNA的检测
2.2.4 cDNA文库的构建和Illumina HiSeq2000测序
2.2.5 数据过滤和de novo拼接
2.2.6 基因功能注释及分类
2.2.7 预测编码蛋白框CDS
2.2.8 SSR分析
2.3 结果与分析
2.3.1 RNA提取质量评估
2.3.2 转录组测序及序列拼接
2.3.3 基因功能注释结果
2.3.4 Unigene的GO功能分类注释
2.3.5 Unigene的KOG功能分类注释
2.3.6 KEGG pathways分析
2.3.7 SSR信息分析
2.3.8 Unigene的编码蛋白(CDS)预测结果
2.4 小结与讨论
2.4.1 小结
2.4.2 讨论
第三章 芍药种子下胚轴萌发前后的差异表达基因分析
3.1 试验材料
3.2 试验方法
3.2.1 差异基因表达水平聚类分析
3.2.2 差异基因GO富集分析
3.2.3 差异基因KEGG富集分析
3.2.4 qRT-PCR分析
3.3 结果与分析
3.3.1 差异表达基因的筛选
3.3.2 差异基因表达模式聚类
3.3.3 差异表达基因的GO功能显著性富集结果
3.3.4 差异表达基因的Pathway显著性富集分析
3.3.5 植物激素信号转导通路中与种子萌发相关的基因的qRT-PCR验证
3.4 小结与讨论
3.4.1 小结
3.4.2 讨论
第四章 DELLA蛋白PlGAI1基因的克隆及功能分析
4.1 试验材料
4.1.1 试验材料及处理
4.1.2 菌株与载体
4.1.3 试验试剂
4.1.4 仪器与耗材
4.1.5 溶液的配制
4.1.6 试验所用引物生物信息学软件
4.2 试验方法
4.2.1 操作前有关器皿及药品的处理
4.2.2 芍药种子总RNA的提取
4.2.3 cDNA的合成
4.2.4 芍药DELLA蛋白PlGAI1基因全长ORF的克隆
4.3 结果与分析
4.3.1 芍药种子总RNA的提取
4.3.2 芍药DELLA蛋白PlGAI1基因全长的克隆
4.3.3 PlGAI1基因编码的蛋白质序列分析
4.3.4 PlGAI1基因编码的蛋白质相关结构的分析
4.3.5 PlGAl1蛋白质二级结构分析
4.3.6 PlGAI1蛋白质三级结构分析
4.3.7 亚细胞的初步定位
4.4 小结与讨论
4.4.1 小结
4.4.2 讨论
第五章 DELLA蛋白PlGAI1基因的原核表达分析
5.1 试验材料
5.1.1 试验材料及处理
5.1.2 菌株与载体
5.1.3 主要生化试剂
5.1.4 仪器与耗材
5.2 试验方法
5.2.1 RNA的提取及cDNA的制备
5.2.2 引物设计与PCR扩增
5.2.3 表达载体pET-32a(+)质粒的线性化
5.2.4 PCR产物与表达载体pET-32a(+)的同源重组
5.2.5 连接产物的转化
5.2.6 质粒提取与鉴定
5.2.7 克隆鉴定
5.2.8 重组蛋白的表达
5.2.9 表达产物的SDS-PAGE检测
5.2.10 重组蛋白的纯化
5.3 结果与分析
5.3.1 RNA的检测和cDNA的检测
5.3.2 提取质粒的检测
5.3.3 PlGAI1基因编码的蛋白在大肠杆菌中的表达
5.3.4 目的蛋白的纯化
5.4 小结与讨论
5.4.1 小结
5.4.2 讨论
第六章 结论
6.1 芍药种子下胚轴萌发前后转录组测序结果
6.2 芍药种子下胚轴萌发前后的差异基因
6.3 成功克隆芍药种子PlGAI1基因
6.4 芍药种子PlGAI1基因编码的蛋白在大肠杆菌中明显表达
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
本文编号：3832487
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【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 芍药概述
1.2 芍药种子休眠的研究进展
1.3 种子休眠的激素调控机制
1.3.1 ABA在种子萌发过程中的作用
1.3.2 BR在种子萌发过程中的作用
1.3.3 乙烯在种子萌发过程中的作用
1.3.4 GA在种子萌发过程中的作用
1.4 DELLA蛋白的研究进展
1.4.1 DELLA蛋白的结构
1.4.2 DELLA蛋白的功能
1.5 RNA-Seq技术的研究进展
1.5.1 RNA-Seq技术的发展
1.5.2 RNA-Seq的优势
1.5.3 RNA-Seq研究基因的差异表达
1.6 本研究的目的意义及技术路线
1.6.1 本研究的目的意义
1.6.2 本研究的内容和技术路线
第二章 芍药种子下胚轴萌发前后转录组样品的测序
2.1 试验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 测序材料准备
2.1.3 试验仪器与试剂
2.2 试验方法
2.2.1 操作前有关器皿及药品的处理
2.2.2 芍药种子总RNA的提取
2.2.3 总RNA的检测
2.2.4 cDNA文库的构建和Illumina HiSeq2000测序
2.2.5 数据过滤和de novo拼接
2.2.6 基因功能注释及分类
2.2.7 预测编码蛋白框CDS
2.2.8 SSR分析
2.3 结果与分析
2.3.1 RNA提取质量评估
2.3.2 转录组测序及序列拼接
2.3.3 基因功能注释结果
2.3.4 Unigene的GO功能分类注释
2.3.5 Unigene的KOG功能分类注释
2.3.6 KEGG pathways分析
2.3.7 SSR信息分析
2.3.8 Unigene的编码蛋白(CDS)预测结果
2.4 小结与讨论
2.4.1 小结
2.4.2 讨论
第三章 芍药种子下胚轴萌发前后的差异表达基因分析
3.1 试验材料
3.2 试验方法
3.2.1 差异基因表达水平聚类分析
3.2.2 差异基因GO富集分析
3.2.3 差异基因KEGG富集分析
3.2.4 qRT-PCR分析
3.3 结果与分析
3.3.1 差异表达基因的筛选
3.3.2 差异基因表达模式聚类
3.3.3 差异表达基因的GO功能显著性富集结果
3.3.4 差异表达基因的Pathway显著性富集分析
3.3.5 植物激素信号转导通路中与种子萌发相关的基因的qRT-PCR验证
3.4 小结与讨论
3.4.1 小结
3.4.2 讨论
第四章 DELLA蛋白PlGAI1基因的克隆及功能分析
4.1 试验材料
4.1.1 试验材料及处理
4.1.2 菌株与载体
4.1.3 试验试剂
4.1.4 仪器与耗材
4.1.5 溶液的配制
4.1.6 试验所用引物生物信息学软件
4.2 试验方法
4.2.1 操作前有关器皿及药品的处理
4.2.2 芍药种子总RNA的提取
4.2.3 cDNA的合成
4.2.4 芍药DELLA蛋白PlGAI1基因全长ORF的克隆
4.3 结果与分析
4.3.1 芍药种子总RNA的提取
4.3.2 芍药DELLA蛋白PlGAI1基因全长的克隆
4.3.3 PlGAI1基因编码的蛋白质序列分析
4.3.4 PlGAI1基因编码的蛋白质相关结构的分析
4.3.5 PlGAl1蛋白质二级结构分析
4.3.6 PlGAI1蛋白质三级结构分析
4.3.7 亚细胞的初步定位
4.4 小结与讨论
4.4.1 小结
4.4.2 讨论
第五章 DELLA蛋白PlGAI1基因的原核表达分析
5.1 试验材料
5.1.1 试验材料及处理
5.1.2 菌株与载体
5.1.3 主要生化试剂
5.1.4 仪器与耗材
5.2 试验方法
5.2.1 RNA的提取及cDNA的制备
5.2.2 引物设计与PCR扩增
5.2.3 表达载体pET-32a(+)质粒的线性化
5.2.4 PCR产物与表达载体pET-32a(+)的同源重组
5.2.5 连接产物的转化
5.2.6 质粒提取与鉴定
5.2.7 克隆鉴定
5.2.8 重组蛋白的表达
5.2.9 表达产物的SDS-PAGE检测
5.2.10 重组蛋白的纯化
5.3 结果与分析
5.3.1 RNA的检测和cDNA的检测
5.3.2 提取质粒的检测
5.3.3 PlGAI1基因编码的蛋白在大肠杆菌中的表达
5.3.4 目的蛋白的纯化
5.4 小结与讨论
5.4.1 小结
5.4.2 讨论
第六章 结论
6.1 芍药种子下胚轴萌发前后转录组测序结果
6.2 芍药种子下胚轴萌发前后的差异基因
6.3 成功克隆芍药种子PlGAI1基因
6.4 芍药种子PlGAI1基因编码的蛋白在大肠杆菌中明显表达
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
本文编号：3832487
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