抗辣椒白绢病钩状木霉几丁质酶基因的克隆与分析

发布时间：2023-07-25 02:21

　　辣椒白绢病是由一种真菌病原菌Sclerotium rolfsli sacc引起的土壤微生物疾病,辣椒感染白绢病损失巨大。生产实践中发现木霉属Trichoderma spp.真菌能够通过一系列复杂的重寄生方式抑制其生长,所以运用木霉属制成的真菌制剂作为一种持续有效生态环保的白绢病防治方法已经得到了广泛的应用。早期我们从醴陵辣椒白绢病感病灾区的土壤中分离鉴定了能拮抗白绢病致病菌的23株木霉,并对搜集到的木霉通过ITS(Internal Transcribed Spacer)序列检测分类,之后检测了其中13株木霉菌Trichoderma spp对致病菌S. rolfsii的抑制效果,发现了不同株间抑菌效果的差异,其中效果最强的是13号木霉,经分类13号木霉为(Trichoderma hamatum)钩状木霉(Th13)。将该木霉为材料,另挑选了5株抑菌率有差异的钩状木霉作对照,开展了抗病相关酶及基因的相关分子生物学研究。对其三种主要的细胞壁降解酶：几丁质酶、碱性蛋白酶和p-1,3-葡聚糖酶进行诱导产酶,对该三种酶的酶产生量和酶学活性进行了检测分析。通过SPSS statics19软件对抑菌率...

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 辣椒白绢病病原菌背景
        1.1.1 病原菌的形态特征
        1.1.2 寄主和症状表现
        1.1.3 生长环境
        1.1.4 白绢病的分布和防治
        1.1.5 主要的防治方法
    1.2 钩状木霉的研究背景
        1.2.0 木霉属的概况
        1.2.1 木霉属的生物防治机制
        1.2.2 木霉的重寄生作用和生防基因
    1.3 研究的意义
    1.4 研究的技术路线
第二章 钩状木霉中重要酶活的测定与分析
    2.1 材料
        2.1.1 菌种
        2.1.2 培养基的配置
        2.1.3 实验所用主要试剂配制
        2.1.4 实验仪器
    2.2 方法
        2.2.1 钩状木霉和致病菌活化和培养
        2.2.2 制备白绢病致病菌细胞壁
        2.2.3 制备诱导培养基诱导酶活表达
        2.2.4 DNS法测量样本中几丁质酶、β-1,3葡聚糖酶酶活力
        2.2.5 Folin酚试剂法检测碱性蛋白酶的酶活力
    2.3 结果与分析
        2.3.1 标准曲线的制作
        2.3.2 几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和碱性蛋白酶酶活力测定结果统计和趋势分析
        2.3.3 SPSS数据分析软件分析各组酶活数据和抑菌率关系显著性
    2.4 讨论
第三章 chit42和prb1基因的编码序列的克隆和chit42表达量分析
    3.1 材料
        3.1.1 研究使用的菌株
        3.1.2 培养基
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 SDS法提取Th13总DNA
        3.2.2 Trizol法提取Th13中总mRNA
        3.2.3 引物设计
        3.2.4 PCR扩增Th13几丁质酶chit42和碱性蛋白酶prb1的CDS片段
        3.2.5 Th13几丁质酶chit42和碱性蛋白酶prb1的cDNA片段扩增
        3.2.6 PCR产物切胶回收
        3.2.7 基因片段比对及其编码氨基酸序列生物信息学分析
        3.2.8 Trizol法提取钩状木霉中的RNA合成cDNA第一链
        3.2.9 RT-PCR半定量检测钩状木霉中chit42基因表达量
    3.3 结果与分析
        3.3.1 Th13总mRNA提取琼脂糖凝胶电泳检测结果
        3.3.2 PCR和RT-PCR产物琼脂糖电泳检测
        3.3.3 扩增得到的DNA序列BLAST在线比对分析
        3.3.4 cDNA和DNA克隆序列比对分析
        3.3.5 氨基酸一级结构分析
        3.3.6 氨基酸保守区结构域分析
        3.3.7 蛋白质的二级结构和三级结构预测
        3.3.8 RT-PCR反应的条件
        3.3.9 半定量PCR检测诱导几丁质酶基因表达量电泳检测
    3.4 讨论
第四章 上游调控序列克隆和比对分析
    4.1 材料
        4.1.1 菌种
        4.1.2 培养基的配置
        4.1.3 试剂
    4.2 方法
        4.2.1 染色体步移技术延伸克隆chit42基因上游序列
        4.2.2 Genome walking反应和琼脂糖凝胶电泳检测
        4.2.3 目的片段回收纯化、测序和拼接
        4.2.4 拼接片段序列用在线软件对调控元件进行分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测条带
        4.3.2 拼接片段在线序列比对
        4.3.3 上游调控序列的分析
    4.4 讨论
第五章 总结
参考文献
作者简介
致谢



本文编号：3836979