利用激光显微切割系统精细分离柑橘珠心胚起始细胞技术体系的构建
发布时间：2023-11-24 17:09
大多数柑橘的单粒种子中合子胚与珠心胚共存,称为柑橘种子特有的多胚现象。多胚性遗传稳定,是繁殖整齐一致的砧木的前提,也是柑橘常规杂交育种的主要障碍。已有研究表明,柑橘的珠心胚起始于胚囊周围的珠心细胞。然而,由于取材限制,大部分研究以均质胚珠作为研究对象。并没有考虑到不同细胞类型的特异性问题,对珠心胚起始发生机制认识还相当有限。激光显微切割(Laser Microdissection,LMD)是一种精确取样技术,在显微镜下精确定位目标组织和细胞,利用激光束从组织切片中快速切割、收集目标组织或细胞用于大分子物质的提取。该技术简便、易行准确度高,已成功的运用于动植物研究,使得分离出珠心胚起始细胞成为可能。因此,利用该技术从特定细胞提取高质量RNA成为研究柑橘多胚形成分子机理的关键。本研究利用石蜡切片对‘伏令夏’橙(Citrus sinensis?Valencia‘)果实切片,观察种子中珠心胚起始发生过程,确定珠心胚起始的关键时期;对比不同切片方法、不同多胚材料珠心胚起始细胞形态、数量确定了显微切割配套切片方法及最佳材料;摸索显微切割参数、切割量、RNA提取及检测方法;成功切割收集‘华柑2号’椪...
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
Abbreviations
第一章 前言
1. 课题的提出
2. 植物无融合生殖现象
3. 柑橘珠心胚研究进展
4. 激光显微切割研究进展
4.1 激光显微切割技术发展和原理
4.2 Leica AS LMD 7000的特点
4.3 激光显微切割技术结合组织切片技术
4.4 激光显微切割技术在植物研究中的应用
4.4.1 植物生殖与胚胎研究
4.4.2 基因表达分析
5. 课题的目的与意义
第二章 激光显微切割材料选择
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 材料及其来源
2.2 实验方法
2.2.1 ‘伏令夏’橙果实石蜡切片方法
2.2.2 ‘伏令夏’橙果实冰冻切片方法
2.2.3 不同柑橘多胚材料果实石蜡切片方法
2.2.4 多胚柑橘种子采集及种子中胚数目统计
3. 结果与分析
3.1 伏令夏橙珠心胚起始发生过程观察及切割时期确定
3.2 适合柑橘珠心胚激光显微切割的切片方法选择
3.3 适合柑橘珠心胚激光显微切割的多胚材料筛选
3.4 激光显微切割所需样品量估计
3.5 不同柑橘多胚材料种子中胚数目统计
4. 讨论
4.1 多胚柑橘材料胚珠中NEI细胞数量及出现时间、位置
4.2 影响激光显微切割NEI细胞材料筛选的因素
第三章 激光显微切割技术体系构建
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 石蜡切片方法
2.2.1 石蜡切片的一般步骤
2.2.2 适合柑橘果实的石蜡切片方法
2.3 激光显微切割方法
2.3.1 开启Leica AS LMD系统
2.3.2 激光切割仪器校准
2.3.3 激光显微切割参数调试
2.3.4 载玻片扫描
2.3.5 勾画目标细胞
2.3.6 收集管准备
2.3.7 正式切割及图像数据收集
2.3.8 取出收集管、关闭系统
2.4 RNA提取
2.5 Agilent 2100 Bioanalyzer RNA检测
3. 结果与分析
3.1 石蜡切片的方法改进
3.1.1 切面选择
3.1.2 切片厚度
3.1.3 展片方法
3.1.4 脱蜡方法
3.2 激光显微切割方法
3.3 Aglient 2100 RNA质量检测结果
3.4 影响RNA质量的因素
4. 讨论
4.1 石蜡切片过程对切割材料RNA质量的影响
4.2 激光显微切割过程对材料RNA质量影响
5. 问题与展望
5.1 问题
5.2 展望
参考文献
致谢
本文编号：3866232
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
Abbreviations
第一章 前言
1. 课题的提出
2. 植物无融合生殖现象
3. 柑橘珠心胚研究进展
4. 激光显微切割研究进展
4.1 激光显微切割技术发展和原理
4.2 Leica AS LMD 7000的特点
4.3 激光显微切割技术结合组织切片技术
4.4 激光显微切割技术在植物研究中的应用
4.4.1 植物生殖与胚胎研究
4.4.2 基因表达分析
5. 课题的目的与意义
第二章 激光显微切割材料选择
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 材料及其来源
2.2 实验方法
2.2.1 ‘伏令夏’橙果实石蜡切片方法
2.2.2 ‘伏令夏’橙果实冰冻切片方法
2.2.3 不同柑橘多胚材料果实石蜡切片方法
2.2.4 多胚柑橘种子采集及种子中胚数目统计
3. 结果与分析
3.1 伏令夏橙珠心胚起始发生过程观察及切割时期确定
3.2 适合柑橘珠心胚激光显微切割的切片方法选择
3.3 适合柑橘珠心胚激光显微切割的多胚材料筛选
3.4 激光显微切割所需样品量估计
3.5 不同柑橘多胚材料种子中胚数目统计
4. 讨论
4.1 多胚柑橘材料胚珠中NEI细胞数量及出现时间、位置
4.2 影响激光显微切割NEI细胞材料筛选的因素
第三章 激光显微切割技术体系构建
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 石蜡切片方法
2.2.1 石蜡切片的一般步骤
2.2.2 适合柑橘果实的石蜡切片方法
2.3 激光显微切割方法
2.3.1 开启Leica AS LMD系统
2.3.2 激光切割仪器校准
2.3.3 激光显微切割参数调试
2.3.4 载玻片扫描
2.3.5 勾画目标细胞
2.3.6 收集管准备
2.3.7 正式切割及图像数据收集
2.3.8 取出收集管、关闭系统
2.4 RNA提取
2.5 Agilent 2100 Bioanalyzer RNA检测
3. 结果与分析
3.1 石蜡切片的方法改进
3.1.1 切面选择
3.1.2 切片厚度
3.1.3 展片方法
3.1.4 脱蜡方法
3.2 激光显微切割方法
3.3 Aglient 2100 RNA质量检测结果
3.4 影响RNA质量的因素
4. 讨论
4.1 石蜡切片过程对切割材料RNA质量的影响
4.2 激光显微切割过程对材料RNA质量影响
5. 问题与展望
5.1 问题
5.2 展望
参考文献
致谢
本文编号：3866232
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/3866232.html
