柑橘原生质体瞬时转化体系的建立及应用

发布时间：2024-04-19 00:10

　　柑橘作为世界第一大水果,因其生物学特性而导致常规育种进程较慢,甜橙基因组数据库为基因工程育种提供了良好平台,但是目前稳定遗传转化及基因功能验证体系并不成熟,瞬时表达技术可以实现短时间内将目标基因表达于受体细胞,为基因-蛋白质研究提供了一种快捷方法。本研究以柑橘叶肉原生质体为主要材料,用绿色荧光蛋白基因作为报告检测基因,采用聚乙二醇(PEG)-Ca介导转化法,在优化原生质体分离技术的前提下,设置PEG种类、PEG浓度、PEG-Ca溶液中甘露醇的浓度、转化热激处理时间、转化质粒浓度以及共培养时间等变量,旨在提高柑橘原生质体瞬时转化效率,并且对该体系进行一定的应用。具体结果如下:1、柑橘原生质体瞬时转化体系的建立。以HB柚叶片为材料,采用真空渗透酶解方法,明显缩短了酶解时间,减少了生物酶对原生质体的伤害,提升了原生质体的均一性,并且实现了柑橘果皮及汁胞原生质体的首次分离与纯化;PEG-Ca介导转化法的优化条件如下:PEG-Ca溶液中PEG种类为PEG4000,浓度为40%,甘露醇浓度为0.3M;热激处理温度为47℃,时间为7min;转化质粒浓度为15μg/3×105个原生质体;转化后原生质体...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２－１血球计数板示意图

离原生质体的活力，常温黑暗环境静置原生质体１－２?ｈ。??２．２．６原生质体密度统计及活力检测方法??原生质体密度统计一般采用血球计数板（如图２－１所示），在普通光学显??微镜下统计完成，具体计数方法如下：?????柯个卞格面＾为１．〇ｍ，．容＾＾Ｏ?’ｍｎ＾?（ｕｌ）?＾???....

图３－１阳性载体ＰＣＲ检测结果图

件进行检测（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕＩｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ）。??双分子荧光互补实验的阳性对照质粒ＹＮ：：?ＳＩＷｏ和ＳＩＣｙｃＢ：：?ＹＣ进行ＰＣＲ??检测，ＰＣＲ扩增引物，电泳检测结果如图３－１所示，与別Ｔｏ基因....

图３－３原生质体活力检测图

＇七（Ｖ??隱?Ｖ??图３－２不同柑橘外植体分离的原生质体。Ａ：叶肉；Ｂ：愈伤组织；??Ｃ：汁胞；Ｄ：果皮；标尺：２０微米。??Ｆｉｇ．３－２?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ?ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｅｘｐｌａｎｔｓ．?Ａ：?ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ；?Ｂ：Ｃａ....

图３－２不同柑橘外植体分离的原生质体

４２°Ｃ、４７°Ｃ、５２°Ｃ、５７°Ｃ恒定金属浴温度下，处理７ｍｉｎ，然后用ＨＤＡ法检测??原生质体活力，在Ｏｌｙｍｐｕｓ?１Ｘ７１倒置荧光显微镜下观察，明场和荧光模式下原??生质体状态如图３－３所示，同时用普通光学显微镜观察血球计数板，并且统计??原生质体个数，具体数据见表３－....

本文编号：3957934