番茄果实转录因子CNR的原核表达与纯化及抗体制备

发布时间：2024-04-20 16:02

　　Colourless non-ripening(cnr)番茄是一种典型的果实成熟突变体,这种突变主要是由于在番茄突变体cnr中LeSPL-CNR启动子上游有一段286 bp序列的胞嘧啶甲基化程度特别高,导致DNA甲基化的改变,但核酸序列没有差异。目前,关于番茄转录因子CNR的研究主要在转录水平,然而蛋白合成后存在翻译后水平的修饰,蛋白水平才是转录因子CNR发挥作用的水平。本研究通过番茄转录因子CNR的原核表达及纯化、多克隆抗体的制备,在蛋白水平上研究番茄转录因子CNR。主要研究结果如下:(1)pET-CNR原核表达载体的构建:根据GenBank中已发表的番茄CNR基因的序列设计引物,用于CNR基因的扩增。以番茄总RNA为模板,反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行CNR基因扩增,获得与预期CNR编码基因大小相符的片段。将该片段和表达载体pET-30a用限制性内切酶BamHI和XhoI切成双黏性末端,纯化后均用T₄连接酶进行定向连接,并转入大肠杆菌感受态Rosetta进行表达。通过测序确定pET-CNR重组载体具有正确的编码框,且测序结果与已发表番茄CNR编码序列...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图5CNR蛋白的小量诱导表达20.0→M：Marker，1-3：单克隆

2019,35(2)5李玲等：番茄果实转录因子CNR的原核表达与纯化及其抗体的制备大（图6，泳道4），表明诱导剂IPTG的最适宜浓度为1.0mmol/L。单一条带的收集液，通过BCA法测定蛋白含量，将蛋白含量≥1.0μg/μL的收集液合并，作为制备多克隆抗体的抗原。94.0→66....

图2-1番茄果实总RNA琼脂糖凝胶电泳Fig2-1TomatofruittotalRNAagarosegelelectrophoresis

第二章pET-CNR原核表达载体的构建取结果茄果实总RNA，然后进行2%的由图2-1所示，可以看出，提取DNA的污染，能够作为下一步理

图2-2重组载体pET-CNR的菌液PCRFigure2-2RecombinantvectorpET-CNRbacteriostaticPCR

图2-2重组载体pET-CNR的菌液PCRecombinantvectorpET-CNRbacterioM：Marker；1：目的片段

图2-3重组质粒pET-CNR的酶切验证

天津农学院硕士学位论文酶切鉴定与测序，用酶XhoI和EcoRI双酶2-3），420bp条带的大小组质粒构建成功。同时进行R序列（NM_001319308.1个碱基比对不上，所以后续

本文编号：3959648