CRISPR/Cas9介导的番茄基因编辑体系的建立

发布时间：2024-05-08 05:25

　　基因组编辑技术是近几年兴起的一项能对基因组完成精确修饰的一种技术,在2012年被Science评为十大重要科学进展之一,在植物功能基因组学及分子设计育种上具有广阔的应用前景。U3和U6启动子能驱动sgDNA的转录,是CRISPR-Cas9系统中的重要元件之一,在番茄中至少有4个U3启动子和10个U6启动子,这些启动子是否都具有转录功能?所以从番茄中筛选出具有高效转录活性的启动子从而提高CRISPR-Cas9系统的特异性。目前关于番茄内源启动子驱动sgDNA实现基因编辑还未见报道,并且番茄内源启动子与外源启动子驱动sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑效率是否有所差异还不清楚。本研究开展了两方面的工作,一方面从番茄中克隆多个候选U3和U6启动子并进行功能鉴定,为构建番茄CRISPR/Cas9基因编辑系统提供高效的的启动子;另一方面将筛选出具有较高转录活性的启动子SlU6-2P4,构建以SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,并同时构建以拟南芥AtU6及AtU6-26为启动子的CRISPR/Cas9编...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1-1CRISPR/Cas9系统机制示意图

个Cas9蛋白介导靶位点的切割，Type分子，还可以对RNA分子进行降解菌将被病毒侵染死亡。as系统是仅由一个Cas9蛋白介导靶位个系统，目前已成功运用于多种生物和crRNA形成的二级结构，合成了一它能引导Cas9蛋白在基因组中特SBs），随后诱发机体启....

图2-1番茄不同截短SlU3-Ps启动子驱动GUS融合表达载体构建Fig.2-1ConstructionofGUSreportergenefusionexpressionvectordrivenbydifferenttomatotruncated248GUSGUST-SlU3-4P5

茄基因编辑体系的建立P的质粒，分别回收目标片段并用T4连接酶连nⅠ进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒命名为SlU3∷GV3101，于28℃倒置培养两天，挑取阳性克隆25μg·mL－1）进行摇菌，培养至对数生长期后提取确后置于-80℃保存鉴定正确的农杆菌菌液和00融合表....

图2-2番茄U3启动子第一轮PCR扩增Fig.2-2ThefirstroundofPCRamplificationoftomatoU3promoters

水漂洗染色后的叶片4~5次以除去残留进行脱色处理，脱色时每3~4小时更换一SlU3-3P、SlU3-4P启动子第1轮扩增产功扩增出SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4启7bp。用BglII和NotI双酶切鉴定SlU3P重组质粒，Nsi....

图2-33种番茄U3启动子的TransferPCR扩增及酶切鉴定500bp590bp420bp622bp661bp629bp420bp

D种番茄U3启动子的TransferPCRplificationandidentificationofthreeM：2kbPlusIIDNA标准分子量；5f；C：T-SlU3-4P4f；2：T-SlU3-启动子片段，目的大片段为第二阶tion;M:....

本文编号：3967563