枳（Poncirus trifoliata）ptr-miR04抗寒功能验证及作用机制解析
发布时间：2025-02-09 19:52
MicroRNA(miRNA)在动植物体内大量存在,并且参与调节植物生长发育及胁迫应答等过程,但关于柑橘抗寒资源—枳(Poncirus trifoliata)低温响应miRNA的研究目前还比较少。本论文在前期研究的基础上,验证了枳中鉴定出的一个低温诱导新microRNA(即ptr-miR04)的抗寒功能,并初步解析了它的调控机制。主要结果如下:1.利用pre-miR04前体转化的T2代转基因烟草植株进行低温处理,表型比较及生理指标(电导率、ROS等)分析表明转基因植株的抗寒性弱于野生型,暗示ptrmiR04负调控植物抗寒性。2.在柠檬中超表达pre-miR04得到了转基因阳性植株。低温处理后,发现转基因柠檬植株叶片萎蔫程度比野生型严重,而电导率、ROS的含量比野生型高,说明超表达ptr-miR04降低了植株抗寒性。利用STTM技术构建了ptr-miR04干涉载体并转化枳,得到了阳性植株。3.生物信息学预测ptr-miR04的靶基因,发现其中一个靶基因为果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase,FBA),低温处理后对枳pre-miR04和FB...
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表(Abbreviation)
1 前言
1.1 课题的提出
1.2 文献综述
1.2.1 植物低温胁迫研究进展
1.2.2 柑橘低温胁迫研究进展
1.2.3 miRNA研究进展
1.2.3.1 植物miRNA的生物合成
1.2.3.2 植物miRNA的作用机制
1.2.3.3 miRNA与植物逆境胁迫
1.2.3.4 柑橘miRNA研究进展
1.2.4 糖代谢与植物逆境应答
1.3 本研究的目的与意义
2 实验材料与方法
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 试剂
2.1.3 载体及菌株
2.2 方法
2.2.1 材料培养与处理
2.2.2 植物RNA提取及cDNA合成
2.2.3 植物材料相关基因表达模式分析
2.2.4 枳ptr-miR04靶基因预测
2.2.5 载体构建
2.2.5.1 构建短串联靶标类似物STTM-miR04干涉载体
2.2.5.2 构建瞬时表达载体
2.2.6 大肠杆菌转化及阳性鉴定
2.2.7 重组质粒转化农杆菌
2.2.8 瞬时转化验证ptr-miR04与靶基因互作
2.2.9 农杆菌介导的柑橘遗传转化
2.2.9.1 材料准备
2.2.9.2 遗传转化
2.2.10 转基因植株阳性鉴定
2.2.10.1 DNA提取
2.2.10.2 PCR鉴定
2.2.11 生理指标测定
2.2.11.1 相对电导率测定
2.2.11.2 DAB、NBT染色
2.2.11.3 过氧化氢(H2O2)含量、抗超氧阴离子活力(anti-O2
-)、丙二醛(MDA)含量测定
2.2.11.4 过氧化物酶(POD)活性、总超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性测定
2.2.11.5 可溶性总糖、葡萄糖、果糖、蔗糖含量测定
2.2.12 统计分析
3 结果与分析
3.1 烟草T2代转基因植株抗寒性验证
3.1.1 转基因烟草PCR及表达量鉴定
3.1.2 转基因烟草低温处理表型鉴定
3.1.3 烟草抗寒生理指标测定
3.2 转基因柠檬抗寒性验证
3.2.1 pre-miR04超表达载体转柠檬及植株阳性鉴定
3.2.2 转基因柠檬抗寒性分析
3.3 ptr-miR04靶基因预测及验证
3.3.1 ptr-miR04靶基因预测
3.3.2 枳基因表达量分析初步验证ptr-miR04靶基因
3.3.3 烟草瞬时表达验证ptr-miR04及靶基因FBA的互作
3.3.4 转基因烟草中pre-miR04与靶基因表达量分析
3.4 转基因材料糖含量分析
3.4.1 转基因烟草糖含量分析
3.4.2 转基因柠檬糖含量分析
3.5 STTM-miR04干涉载体构建及枳遗传转化
3.5.1 STTM-mi R04干涉载体图
3.5.2 STTM-miR04干涉载体转化枳及转基因植株鉴定
4 讨论
4.1 ptr-miR04降低植株抗寒能力
4.2 ptr-miR04可能通过FBA参与到糖代谢途径
4.3 miR04可能参与响应多种逆境胁迫
参考文献
附录
Ⅰ 附表
Ⅱ 附图
致谢
本文编号：4032779
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【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
缩略词表(Abbreviation)
1 前言
1.1 课题的提出
1.2 文献综述
1.2.1 植物低温胁迫研究进展
1.2.2 柑橘低温胁迫研究进展
1.2.3 miRNA研究进展
1.2.3.1 植物miRNA的生物合成
1.2.3.2 植物miRNA的作用机制
1.2.3.3 miRNA与植物逆境胁迫
1.2.3.4 柑橘miRNA研究进展
1.2.4 糖代谢与植物逆境应答
1.3 本研究的目的与意义
2 实验材料与方法
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 试剂
2.1.3 载体及菌株
2.2 方法
2.2.1 材料培养与处理
2.2.2 植物RNA提取及cDNA合成
2.2.3 植物材料相关基因表达模式分析
2.2.4 枳ptr-miR04靶基因预测
2.2.5 载体构建
2.2.5.1 构建短串联靶标类似物STTM-miR04干涉载体
2.2.5.2 构建瞬时表达载体
2.2.6 大肠杆菌转化及阳性鉴定
2.2.7 重组质粒转化农杆菌
2.2.8 瞬时转化验证ptr-miR04与靶基因互作
2.2.9 农杆菌介导的柑橘遗传转化
2.2.9.1 材料准备
2.2.9.2 遗传转化
2.2.10 转基因植株阳性鉴定
2.2.10.1 DNA提取
2.2.10.2 PCR鉴定
2.2.11 生理指标测定
2.2.11.1 相对电导率测定
2.2.11.2 DAB、NBT染色
2.2.11.3 过氧化氢(H2O2)含量、抗超氧阴离子活力(anti-O2
-)、丙二醛(MDA)含量测定
2.2.11.4 过氧化物酶(POD)活性、总超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性测定
2.2.11.5 可溶性总糖、葡萄糖、果糖、蔗糖含量测定
2.2.12 统计分析
3 结果与分析
3.1 烟草T2代转基因植株抗寒性验证
3.1.1 转基因烟草PCR及表达量鉴定
3.1.2 转基因烟草低温处理表型鉴定
3.1.3 烟草抗寒生理指标测定
3.2 转基因柠檬抗寒性验证
3.2.1 pre-miR04超表达载体转柠檬及植株阳性鉴定
3.2.2 转基因柠檬抗寒性分析
3.3 ptr-miR04靶基因预测及验证
3.3.1 ptr-miR04靶基因预测
3.3.2 枳基因表达量分析初步验证ptr-miR04靶基因
3.3.3 烟草瞬时表达验证ptr-miR04及靶基因FBA的互作
3.3.4 转基因烟草中pre-miR04与靶基因表达量分析
3.4 转基因材料糖含量分析
3.4.1 转基因烟草糖含量分析
3.4.2 转基因柠檬糖含量分析
3.5 STTM-miR04干涉载体构建及枳遗传转化
3.5.1 STTM-mi R04干涉载体图
3.5.2 STTM-miR04干涉载体转化枳及转基因植株鉴定
4 讨论
4.1 ptr-miR04降低植株抗寒能力
4.2 ptr-miR04可能通过FBA参与到糖代谢途径
4.3 miR04可能参与响应多种逆境胁迫
参考文献
附录
Ⅰ 附表
Ⅱ 附图
致谢
本文编号：4032779
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