一株极地海洋红酵母虾青素生物活性和发酵调控的研究

发布时间：2020-04-20 00:11

【摘要】：随着经济的发展与科技的进步,人们对生活品质要求日益提高,而全球环境尤其是海洋环境问题日益凸显。海洋红酵母作为海洋环境中一类抗逆性极强的优势菌群,菌体营养成分丰富,能够代谢包括虾青素在内的多种类胡萝卜素,且具有降解石油化合物及净化水体等多种生理功能,近年来成为研究热点。虾青素因其具备极强的抗氧化、衰老能力,以及着色功能,在食品、医药、化妆品等行业有广阔的应用前景。虾青素等类胡萝卜素无法在动物体内自发生成,目前微生物是类胡萝卜素获取的良好来源。海洋红酵母能够代谢产生大量类胡萝卜素,且具备发酵条件简单、生长周期短等特点,因此,本研究以极地海洋红酵母Rhodotorula sp.为目标,探究其高效液相色谱洗脱条件,优化其发酵培养方式,分离纯化其代谢产物以及对代谢产物的生物活性进行了研究。首先是高效液相色谱洗脱条件的确立。采用高效液相色谱法对海洋红酵母Rhodotorula sp.的代谢产物进行分析测定。对乙酸铵甲醇和甲酸乙腈两个体系进行择优选取,通过不同时间及流动相配比的反复调试分析,最终确立了最优的梯度分离条件:50 m M乙酸铵和甲醇体系(0-15 min:1%甲醇,99%50 m M乙酸铵;15-60 min:60%甲醇,40%50 m M乙酸铵),检测波长265 nm,流速1 m L/min,柱温35℃,安谱C18柱(25 mm×4.6 mm,5μm),进样量10μL。对发酵液的制备方式进行了研究,通过对原始发酵液、上清液发酵液以及菌体发酵液进行高效液相色谱分析,最终采用处理方式为:在原始发酵液中加入适量甲醇,使用旋转蒸发仪将其浓缩制备成待测样品。其次是海洋红酵母Rhodotorula sp.主要代谢产物的确定以及优化其发酵培养条件。对虾青素标准溶液进行高效液相色谱分析,初步进行推断其主要代谢产物即第19.4 min中出峰的代谢产物为虾青素。进一步通过质谱分析以及核磁共振分析,确定海洋红酵母Rhodotorula sp.的主要代谢产物是虾青素,产量为18.6mg/m L。对其产虾青素的发酵培养条件进行优化,通过单因素实验表明,海洋红酵母Rhodotorula sp.发酵生成虾青素的最优乙酰水杨酸的添加量为100.00 mg/L,最优硫酸锌的添加量为100.00 mg/L,最优发酵时间为5天。采用响应面法对海洋红酵母Rhodotorula sp.产虾青素发酵培养条件进行优化,建立了海洋红酵母Rhodotorula sp.发酵培养条件的回归模型,对回归方程求解,当虾青素产量达到最大值27.00 mg/m L时,发酵时间为6.64天,硫酸锌添加量为113.50 mg/L,乙酰水杨酸添加量为111.00 mg/L。为方便实际操作,由该模型优化的发酵培养条件为:发酵时间为6天,硫酸锌添加量为113.00 mg/L,乙酰水杨酸添加量为111.00 mg/L。此条件下,虾青素产量为28.40 mg/m L,与模型预测相近,进一步验证了该模型的可靠性。经过优化后的虾青素产量提高了52.7%。最优的海洋红酵母Rhodotorula sp.产虾青素的发酵条件为:活化培养基:葡萄糖(20 g/L),牛肉膏蛋白胨(10 g/L),酵母提取物(5 g/L),氯化钠(10 g/L),硫酸镁(3 g/L),磷酸氢二钾(7 g/L),活化1天。发酵培养基:葡萄糖(20 g/L),牛肉膏蛋白胨(10 g/L),酵母提取物(15 g/L),氯化钠(10 g/L),硫酸镁(0.15 g/L),磷酸氢二钾(0.25 g/L),吐温(1 g/L),硫酸锌(113 mg/L),乙酰水杨酸(111 mg/L),发酵6天。最后是对海洋红酵母Rhodotorula sp.的代谢产物进行分离纯化以及对代谢产物的生物活性进行相关研究。使用制备型高效液相色谱,分离纯化得到了5种代谢产物,使用高效液相色谱、质谱以及核磁共振分析,明确了这5种化合物是虾青素的不同构型。对海洋红酵母Rhodotorula sp.的主要代谢产物虾青素进行了纤溶活性评价、DPPH自由基清除能力评价、羟自由基清除能力评价、超氧阴离子清除能力评价、红外光谱分析以及紫外波长吸光度分析。海洋红酵母Rhodotorula sp.代谢产生并分离纯化得到的虾青素不具备纤溶活性能力;稀有的极地海洋红酵母来源的虾青素具有较高的抗氧化活性。在清除DPPH自由基方面,其清除能力在低浓度时次于维生素C,在高浓度时与维生素C相当,显著优于海洋红球藻源虾青素和维生素E;在清除羟自由基与超氧阴离子方面,其清除能力显著优于Vc、Ve和AXH。极地海洋红酵母来源的虾青素的抗氧化活性优良,且优于Vc、Ve和AXH;在红外光谱中,由于虾青素结构中的C=O键、芳香族里的C=C键以及C-C共轭体系中的C-H键的伸缩振动从而形成了3个明显的吸收峰;通过紫外分光光度计在200-600 nm处对虾青素的吸光度的扫描,得到虾青素在480nm出有最大特征性吸收。
【图文】：

洗脱,梯度,海洋红酵母,洗脱条件

上海海洋大学硕士学位论文2.2.3 海洋红酵母（Rhodotorula sp.）的 HPLC 条件的优化采用高效液相色谱法分析检测海洋红酵母Rhodotorula sp.的发酵次生代谢产物。取 1 mL 制备好的三种样品分别使用 0.22 μm 的有机相滤膜至高效液相棕色瓶里，并使用分析型高效液相色谱仪进行测定。高效液相色谱的洗脱条件建立了两个体系，，分别为甲酸乙腈体系和乙酸铵甲醇体系。对这两个体系分别进行梯度浓度的调整，以确定最优液相色谱洗脱条件，洗脱梯度如图 2-1 所示。检测波长265 nm，柱温 35 ℃，安谱 C18 柱（25 mm ×4.6 mm, 5 μm），进样量为 10 μL 。

乙腈,甲酸,洗脱方法,液相色谱图

表 2-1 甲酸乙腈体系洗脱方法Table 2-1 Method for eluting formic acid acetonitrile system时间（min） % 0.1%甲酸 %乙腈流量（mL/min）0.0 99 1 115.0 99 1 160.0 55 45 1
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.72;TQ920.1

【参考文献】