嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达及发酵优化

发布时间：2020-04-21 06:58

【摘要】：麦芽糖淀粉酶,又称生麦芽糖α-淀粉酶(Maltogenicα-amylase),能水解麦芽三糖、淀粉及部分糊精生成麦芽糖,可用于淀粉糖化、食品烘焙、面粉改性等领域。尤其在食品烘焙方面,能够水解面包中的淀粉,防止淀粉颗粒与蛋白质形成铰链,延长商品的货架期,应用效果良好。本研究构建了含B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶基因的重组质粒amyM/pHY300PLK,并在此质粒上对启动子和信号肽进行优化,转入食品安全菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中进行重组表达。同时研究了重组酶的酶学性质,在摇瓶及3-L罐水平上进行发酵优化,提高了麦芽糖淀粉酶的表达水平。主要研究结果如下:(1)构建了含B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶基因的重组质粒 amyM/pHY300PLK。在此质粒基础上,研究了7个组成型启动子(amyE_((B.S))、amyE、aprE、gsiB、HpaII、SrfA、xyl A_((B.S)))及2个诱导型启动子(xylA、ManP)对麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中表达的影响。结果表明,以amyE_((B.S))为启动子,33℃下在TB培养基中进行摇瓶发酵48 h,麦芽糖淀粉酶表达最好,酶活最高为145.8 U·m L~(-1)。(2)通过Takara信号肽筛选系统中商品化的载体pEB-S及Bacillus subtilis RIK1285宿主菌,从173种信号肽中筛选出三株使麦芽糖淀粉酶表达量高的信号肽。鉴定其信号肽,分别为引导目的蛋白从Sec途径分泌的YvcE、YncM信号肽和引导目的蛋白从Tat途径分泌的LipA信号肽。将这些信号肽与含amyE_((B.S))启动子的表达载体进行重组,并转入Bacillus subtilis CCTCC M 2016536表达宿主中进行麦芽糖淀粉酶的表达。结果表明,分别以YvcE、YncM及LipA作为信号肽时,在33℃下,以TB培养基进行摇瓶发酵48 h,酶活分别为250.7 U·m L~(-1)、194.8 U·mL~(-1)及189.2 U·m L~(-1),是未更换信号肽前的1.72、1.33及1.29倍。(3)考察重组麦芽糖淀粉酶的酶学性质,结果表明,以可溶性淀粉为底物,麦芽糖淀粉酶淀粉水解比活力为2646 U·g~(-1),K_m为0.95 g·L~(-1),k_(cat)/K_m为12640.4 s~(-1)·g·L~(-1)。重组酶的最适反应pH为5.5,最适温度为60℃。在60℃下进行热稳定性的考察,结果表明重组酶非常稳定,半衰期长达325 h。(4)对重组菌进行发酵优化,首先在摇瓶水平上对重组菌进行培养基组成的优化,结果表明最佳培养基成分为:酵母浸膏25 g·L~(-1)和大豆蛋白胨5 g·L~(-1)、葡萄糖5 g·L~(-1)、Fe~(3+)1 mmol·L~(-1)。在此条件下,摇瓶发酵48 h后麦芽糖淀粉酶酶活为371.7 U·m L~(-1)。以摇瓶发酵培养基为基础,在3-L罐水平上优化了重组菌发酵产酶的条件。结果表明,在37℃下,以葡萄糖作为补料培养基中碳源,以酵母浸膏为氮源,C/N比为1:1下进行发酵,麦芽糖淀粉酶酶活最高为2273.6 U·mL~(-1)。
【图文】：

图 1-1 麦芽糖淀粉酶的水解及转糖苷作用Fig. 1-1 Hydrolysis and transglycosylation of maltogenic amylase人[9]在 1999 年将 B. stearothermophilus 麦芽糖淀粉酶的结构解析芽糖淀粉酶在结构上有与其他糖苷水解酶 GH13 家族成员同样的

麦芽糖淀粉酶的主要来源 ，包括嗜热脂s)[11]、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)[12]、地绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)[14-15]、喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)[17]、枯草芽孢杆杆菌是一种嗜热性需氧芽孢杆菌，兼性厌氧，对评价的标准检测菌株，其最高生长温度可达 80℃左来源的麦芽糖淀粉酶，，在性质上也有很大的区别糖淀粉酶在细菌麦芽糖淀粉酶中因温度稳定性最0]。酶的应用酶作为一种新型的酶制剂，主要用于淀粉糖化、食图 1-2 B. stearothermophilus 麦芽糖淀粉酶的蛋白质三维Fig. 1-2 Structure of B. stearothermophilus maltogenic amy
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925.1

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本文编号：2635500