脂酶催化结构脂的制备及酯交换过程中酰基迁移机理的量子化学模拟探究

发布时间：2020-04-24 17:32

【摘要】：部分氢化起酥油含有一定量的反式脂肪酸(TFA),而摄入过多的TFA会增加心血管疾病发生的风险。脂酶催化酯交换方法常常被用来合成具有一定理化特性的起酥油,樟树籽仁油(CCSO)中含有丰富的中链脂肪酸(MCFA)(C10:0,59%;C12:0,34.2%),MCFA不仅能被人体快速吸收,还能降血脂及胆固醇,因而通过脂酶催化酯交换方法将CCSO用于制备起酥油油脂基料对健康有益。另一方面,尽管脂肪酶具有专一的催化选择性,但是研究发现专一性脂酶催化酯交换过程中存在酰基迁移现象,不仅会产生游离脂肪酸、甘油三酯异构体、甘油二酯等多种副产物,还会导致目标结构脂产率和底物利用率的降低。虽然目前很多学者认为酰基迁移机理是形成五元环中间体的亲核取代过程,但由于过渡态和中间体的难捕获难检测而无法深入研究和证实酰基迁移机理的假设。近年来计算机模拟方法获得了迅速的发展,采用该方法能够解释、扩展实验得到的结论。当前,量子化学模拟作为计算模拟方法中的一类方法,已经成为能在分子水平上理解脂酶催化反应的重要手段,因此采用量子化学模拟手段能找出反应过程中的过渡态和中间体,从理论上研究阐明酰基迁移机理从而控制酰基迁移程度,对脂酶催化制备结构脂的工业化生产具有重要意义。首先,本研究采用专一性脂酶TL IM,按一定的比例将CCSO、茶油(COO)和完全氢化棕榈油(FHPO)进行sn-1,3位置随机酯交换,制备含有MCFA的起酥油油脂基料。结果显示CCSO、COO和FHPO比例为2:2:5的酯交换后的产物(IP),其熔点为42.4°C,符合商业起酥油的熔点要求,其所含脂肪酸主要为棕榈酸(C16:0,约40%),硬脂酸(C18:0,约20%)和油酸(9cC18:1,约16%)。从DSC数据分析得到的固体脂肪含量(SFC)曲线图表明大部分SFC在25-40°C仍被保留,三个比例(2:2:4;2:2:5;2:2:6)在35°C的SFC分别为20.4%,20.5%和25.5%。X射线衍射图谱表明物理混合(PB)的脂肪晶型除了β'晶型的存在,还有未知的晶型(峰4.02?),但IP中主要以单一的β'晶型为主。此外,微分干涉显微镜显示IP中的脂肪微观结构为细小颗粒状晶体(20μm),而PB则是密集的不规则叶状晶体(55μm),差异明显,是因为酯交换反应后产生了几种新型的甘油三酯结构(CPO,LaOP,LaPP,COS,CPS)。以上结果暗示脂酶催化CCSO、COO和FHPO制备的IP可以用于起酥油油脂基料。其次,利用B3LYP密度泛函和6-31G(d,p)方法基组在Gaussian 09软件建立并优化了分子内的无酶非催化途径模型(1,2-二乙酸甘油酯,1,2-DA);根据实验得到脂酶4TGL的晶体结构,用分子对接软件Discovery Studio 2.5建立了包含123个原子的脂酶催化途径模型(1,2-DA-4TGL),并采用相同的优化条件在Gaussian 09软件上得到了初始模型。经模拟发现,分子内发生的无酶非催化途径,分步过程比协同过程的限速步骤能垒更低(41.855.4 kcal/mol),表明在室温下分步过程更容易发生。此外,一个水分子参与的分步过程进一步降低了能垒至31.7 kcal/mol,表明水分子在反应中起着至关重要的作用,尽管如此,该能垒在室温下依然导致了反应在常温下不容易发生。另一方面,脂酶参与的催化途径得到了四步反应机理:(1)His235去质子化Ser144,同时Ser144夺取底物1,2-DA sn-1位置上的羟基质子,实现双质子的转移;(2)底物1,2-DA sn-1上的氧阴离子亲核攻击sn-2羰基碳,形成五元环;(3)Ser144被His235重新质子化,但Ser144却质子化了底物1,2-DA sn-2上新形成的羰基氧阴离子,实现双质子的返回;(4)伴随着质子从sn-2羰基碳转移至sn-1酯氧,一个水分子参与的五元环打开使1,2-DA变成了1,3-DA,实现了酰基迁移的过程。其中第4步是整个反应的限速步骤,能垒为18.8 kcal/mol,与文献报道的实验值(17.8 kcal/mol)符合地很好。有趣的是,我们还发现脂酶和一个水分子参与的酰基迁移过程中,作为广义酸/碱的脂酶催化三联体(Asp-His-Ser)和“质子穿梭机”的水分子可以协同降低反应所需能垒。整体而言,脂酶参与催化途径的酰基迁移比分子内的无酶非催化途径低约2倍的能量势垒,这一结果暗示脂酶可降低酰基迁移反应的能垒、加速酰基迁移的速率。
【图文】：

酯交换,酰基,官能团

第 1 章前言基迁移一定条件下，酰基从一个官能团移动到另一个官能团称之为酰交换过程中是指 TG 中 sn-1, 2-DG (sn-2-DG)位脂肪酸迁移至G)位，反之亦然（图 1.1）。作为酯交换催化过程中的副反应，成结构脂的质量和得率，涉及 TG 中酯键的水解和再酯化[31]。被认为是单甘油酯（Monoglyceride, MG），二甘油酯（Diglyc的合成，纯化和表征中存在的主要问题[32]，过去许多学者都研

酰基,迁移机理

（3）酶本身及酶载体（酶含量与酰基迁移呈正相关，因为脂肪酶（如树脂和二氧化硅等载体）的载体会诱导酰基迁移[40, 41]）。（4）其他因素（酰基基团的支链化度，不饱和度和长度也会通过 DG 和 MG 的平衡分布影响酰基迁移：a. 含支链脂肪酸越多的单甘酯酰基迁移速率要快；b. 含不饱和脂肪酸越多的单甘酯酰基迁移速率要快；c. 含短链脂肪酸越多的单甘酯酰基迁移速率要快[42]）。尽管很多学者对酰基迁移的影响因素进行了研究，酰基迁移的机理仍不清晰。图 1.2 显示了推测的分子内酰基迁移机理，该机理通过 sn-2 亲核取代发生，第一步是 TG 的水解，其次是 2-MG 异构化成 1-MG，进而被脂酶化成 1,3-DG，即该机理是由游离羟基氧的电子亲核攻击酯羰基碳，形成五元环（缩酮）中间体或原酯（Thoester），，进而酯碳氧单键的裂解开环导致产物的形成。Lortie 等[43]发现，在反应的早期阶段没有观察到三油酸甘油酯的形成，暗示了酰基迁移是分子内的反应（Intramolecular reaction, IR）。Tran 等[44]则发现伯羟基氧比仲羟基的亲核进攻效果更强，因此仲羟基到伯羟基的酰基转移是有利反应的进行的，也侧面印证了该机理。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS221

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