拜氏梭菌CoA转移酶过表达基因工程菌的构建及其发酵性能的研究

发布时间：2020-04-25 04:55

【摘要】：丁醇作为最具潜力的新型清洁燃料之一具有热值与汽油相当、容易运输、燃烧无污染等优点。在丁醇的各种生产方法中,微生物发酵法(ABE发酵)因具有环保清洁、不需要使用催化剂、反应条件温和等优势而成为主要研究方法。拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)具有底物适应谱广、遗传性状稳定等优点,是ABE发酵的常用菌株,但是,其丁醇产量低是一直没有突破的瓶颈,而CoA转移酶是启动梭菌溶剂合成途径的关键酶,在梭菌中过表达该酶对提升梭菌的丁醇产量具有重要意义。因此,本文利用课题组保藏的C.beijerinckii NCIMB 8052,构建了CoA转移酶过表达基因工程菌,并对其进行了发酵性能分析。主要研究结果如下:(1)构建了CoA转移酶过表达基因工程菌。设计了CoA转移酶基因ctfAB特异性引物,以C.beijerinckii NCIMB 8052基因组为模板,扩增得到了ctfAB片段,将其与pMD-19T进行了连接,完成了T/A克隆,测序验证无误后,将经过Bsr GI和HindIII双酶切的ctfAB片段和载体pMTL007进行了连接,构建了CoA转移酶过表达载体pMTL007-ctfAB,并将其电转化入C.beijerinckii NCIMB 8052中,通过菌落PCR和SDS-PAGE电泳验证实验,证实CoA转移酶过表达基因工程菌构建成功;(2)对工程菌进行了发酵性能分析。工程菌和野生菌进行了分批摇瓶发酵,分别对两者的发酵液pH值、发酵液残糖量、菌体生物量和溶剂产量进行了检测,结果发现:工程菌提前进入产溶剂期,其pH值比野生菌提前出现上升趋势;在发酵12-24h这一时段内,工程菌的糖消耗速率比野生菌提高15%,工程菌最终发酵液残糖量比野生菌降低43.3%;发酵进行到18 h时,工程菌进入稳定期,野生菌则继续生长,生长速度超过工程菌,野生菌的最大菌体生物量大于工程菌;工程菌最高丁醇产量达11.53±0.63 g/L,比野生菌提高4.5%,总溶剂最高产量达16.84±0.77 g/L,比野生菌提高4.2%。本研究成功构建了C.beijerinckii NCIMB 8052的CoA转移酶过表达基因工程菌,为在C.beijerinckii NCIMB 8052中进一步开展CoA转移酶的研究提供了一种可能,也为提高ABE发酵的丁醇产量提供了一种途径。
【图文】：

图 2-1 ctfAB 基因片段 PCR 扩增结果Marker：DNA Marker III；泳道 2-8：ctfAB 基因片段Fig 2-1 The result of PCR amplification for ctfAB gene sequenceMarker：DNA Marker III；Lane2 to 8：ctfAB gene sequence

27 2-2 ctfAB 基因片段胶回收 III；泳道 ctfAB gene：回收l purification of ctfAB gene seLane ctfAB gene：The purifie隆糖凝胶电泳检测结果如图带，转化效率较高。经
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ923;TQ223.124

【参考文献】

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本文编号：2639836