匍枝根霉纤维素酶高产菌株的选育及发酵控制

发布时间：2020-04-30 08:14

【摘要】：纤维素酶作为一种重要的工业酶制剂,具有环保、高效地将纤维素转化成人类需要的能源和其他工业原料的功能,因而被广泛应用于畜牧、造纸、食品工业等诸多领域。然而,纤维素酶酶活低、生产成本高是制约其应用的关键因素,本论文通过诱变选育获得一株高产纤维素酶的匍枝根霉TZ-03菌株。并通过对TZ-03培养基组分和培养条件的优化及10 L发酵罐放大实验,成功提高了纤维素酶活,使其在以微晶纤维素为唯一碳源的培养基中84 h的滤纸酶活(FPA)高达21.32 IU/m L。实验过程中发现诱变后β-葡萄糖苷酶活(BG)提高明显,因此对其分子机制和结构功能进行初步研究。主要工作如下:(1)以匍枝根霉TP-02为出发菌株,通过紫外和甲基磺酸乙酯(EMS)诱变及后续筛选获得了单因子诱变高产突变株。并从中选取酶活较高的5株进行复合诱变,最终得到一株高产菌TZ-03,其FPA酶活达到4.96 IU/m L,较TP-02提高了37.8%。(2)以滤纸酶活为指标,从碳源、氮源、氨基酸种类、聚乙二醇系列(PEGs)、培养温度、初始p H这些方面进行培养基组分和培养条件优化。采用正交试验设计实验优化后的培养基组分确定为:微晶纤维素20 g/L,鱼粉蛋白胨10 g/L,麸皮浸出汁2.5%,Ca Cl2 3g/L,Mg SO4·7H2O 4 g/L,KH2PO4 3 g/L,谷氨酰胺1.5 g/L,PEG-4000 0.2 g/L,Tween 80 200μL/L,微量元素液1 m L/L。培养温度为30℃,初始p H为5.0。此条件下,FPA酶活在108 h达到最大值12.75IU/m L,β-葡萄糖苷酶活(BG)达到24.10 IU/m L,内切酶活(EG)达到15.98 IU/m L,外切酶活(CBH)达到9.70 IU/m L。(3)根据摇瓶优化的结果进行10 L发酵罐放大实验。装液量为5 L,初始罐压0.08 MPa,通气量为0.6 vvm,转速为300 rpm,控制发酵过程中的溶氧维持在30%左右,p H维持在4.8,发酵24 h后发酵液中还原糖含量维持在1.2 mg/m L左右。此条件下,滤纸酶活在84 h达到峰值21.32 IU/m L,与摇瓶发酵相比提高了89.8%,时间缩短了近24 h。CBH酶活在72 h达到最大值16.94 IU/m L,BG在84 h达到峰值41.06 IU/m L,EG酶活也在84 h达到最大值26.76 IU/m L。(4)通过TP-02和TZ-03中BG酶活和转录水平的比较,发现诱变后BG酶活提高了1.51倍,转录水平上调了90.19%,其可导致蛋白表达量的提高,从而可能引起BG酶活的提高。进而钓取了β-葡萄糖苷酶基因bgl4,利用DS 3.0软件进行BGL和BGL IV的同源建模,并以纤维二糖为底物进行分子对接。结果表明,BGL和BGL IV具有典型的(α/β)8-TIM的筒形折叠结构,诱变前,酶分子内部形成了一个隧道形状的口袋与底物相互作用,纤维二糖结合到口袋深处;诱变后活性中心发生轻微偏移,纤维二糖不再深入结合到酶分子内部的隧道空腔,而是在表面形成的凹槽处发生作用,这种结构使得活性中心更大,对原活性中心存在的受力不均、底物堆积等情况可以有效解决,同时诱变后氨基酸与配体形成的氢键数量增加。诱变后BGL IV活性中心构象变化可能更有利于酶与底物的结合,对酶活的提高也有一定的促进作用。
【图文】：

致死率,紫外照射,紫外诱变,照射时间

2.3.2.1 紫外诱变最佳时间的确定统计经紫外诱变不同时间后 PDA 平板上生长的菌落数，计算致死率。结果如图2-2所示，在0-6min内随着UV照射时间的延长，菌株的致死率明显增加。照射时间为 30 s 时，菌落致死率为 15.20%，而当照射时间增加至 5 min 时，致死率已达到 96.15%，照射 6min 后，致死率为 100%。一般而言

酶活,突变株,紫外,滤纸酶活

图 2-2 不同紫外照射时间的致死率g.2-2 Lethal rate curve of the strain on UV irradiation time产菌株的筛选选培养基上透明圈的大小[87]，选取紫外诱变后透复筛，通过滤纸酶活测定，，筛选出紫外诱变后酶V 01-08。如图 2-3 所示，通过发酵液中滤纸酶活为：4.07、4.01、3.73、3.80、4.22、3.66、3.78、4后明显，其 FPA 酶活较 TP-02（3.39IU/mL）提高00.20.41 2 3 4 5 6 7照射时间/min44.55
【学位授予单位】：安徽工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925

【参考文献】