产木聚糖酶菌株的选育、发酵优化及酶学性质的研究

发布时间：2020-05-06 13:15

【摘要】：木聚糖酶是能将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的复合酶系,主要包括内切β-1,4-D-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶,可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。因此,木聚糖酶可以广泛应用于食品、医药、能源、造纸和饲料等行业和领域。本研究所使用的异硫链霉菌(Streptomyces althioticus)主要产内切β-1,4-D-木聚糖酶,其可以随机切割木聚糖主链骨架的β-1,4糖苷键产生木糖和低聚木糖或带有侧链的寡聚木糖。本研究首先通过紫外和亚硝酸钠复合诱变的方法筛选出一株产木聚糖酶活较高的菌株,然后通过单因素优化筛选出了碳源、氮源和无机盐等成分,再通过Plackett-Burman设计实验、最陡爬坡实验和不显著因素的最低添加量实验,最后通过Central Composite Design设计实验等方法对该菌株产木聚糖酶的发酵培养基进行了优化,同时对分离纯化后的木聚糖酶进行了酶学性质研究,最后研究了该酶与纤维素酶协同作用水解玉米芯粉的效果,主要研究结果如下。(1)通过紫外和亚硝酸钠复合诱变的方法,筛选得到一株产木聚糖酶活力最高的菌株,经测定该菌株产木聚糖酶活为40.21U/m L。通过测定细胞干重的方法测得该菌株的生长曲线为,0h~4h为适应期、4h~28h为对数生长期、28h~36h为稳定期。因此,在后期发酵时,选择生长24h的细胞作为种子培养液接种于发酵培养基中。(2)采用单因素优化法确定了菌株产木聚糖酶的最适发酵条件为发酵周期108h,发酵温度40℃,接种量4%,摇床转速为180r/min,装液量50m L/250m L,初始发酵p H为7.0。通过Plackett-Burman设计实验筛选出对菌株产木聚糖酶活力有显著性影响的成分,然后通过最陡爬坡实验和不显著因素的最低添加量实验,确定了培养基中各组分的添加量,最后通过Central Composite Design设计实验得到最佳发酵培养基组成,分别为玉米芯粉12.77g/L、硝酸钾1.67g/L和磷酸氢二钠1.45g/L,其他培养基组分为磷酸氢二钾0.4g/L、磷酸二氢钠0.4g/L和磷酸二氢钾0.4g/L。预测酶活为184.6U/m L,实验测得酶活为178U/m L,结果相差不大,说明采用上述一系列优化方法得到的实验结果是合理可靠的。优化发酵条件和培养基组成后,木聚糖酶酶活是优化前的4.4倍。(3)通过硫酸铵分级盐析、Hi Prep 26/10 Desalting脱盐、Hiprep DEAE FF 16/10离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等分离纯化步骤,纯化倍数达到10.37,最终得到比酶活为952U/mg的高纯度样品,通过SDS-PAGE法测得分子量约为35.0KDa。对分离纯化后的木聚糖酶进行酶学性质研究,得到木聚糖酶最适反应温度为55℃,在40℃、45℃和50℃条件下保温4h,残余酶活相对稳定,说明该酶在40℃~50℃温度范围内有很好的稳定性。该木聚糖酶最适反应p H为5,在p H4~p H9范围内保温4h,残余酶也具有较好的稳定性。(4)通过单因素法分别优化了木聚糖酶、纤维素酶以及木聚糖酶和纤维素酶协同作用水解玉米芯粉的最佳条件,用木聚糖酶水解未预处理玉米芯粉的最佳条件为p H6,酶添加量为110U,水解时间为7h,产生的还原糖量为7.38mg;用纤维素酶水解未预处理玉米芯粉在p H5.5,酶添加量为150U,水解时间为28h,产生的还原糖量为39.69mg;先用纤维素酶再用木聚糖酶水解玉米芯粉的最佳条件为p H5.5,酶添加量为110U,水解时间为7h,产生的还原糖量为4.08mg;先用木聚糖酶再用纤维素酶水解玉米芯粉的最佳条件为p H4.5,加酶量为230U,产生的还原糖量为49.53mg。同时,探讨了玉米芯粉经过蒸汽爆破预处理后,再分别用这四种工艺水解玉米芯粉,产生的还原糖量分别为,经过木聚糖酶水解玉米芯粉产生的还原糖量为9.48mg,纤维素酶水解水解玉米粉产生的还原糖量为52.56mg,先用纤维素酶再用木聚糖酶水解玉米芯粉产生还原糖量为8.27mg,先用木聚糖酶再用纤维素酶水解玉米芯粉产生还原糖量为64.89mg。结果表明预处理后的玉米芯粉,先用木聚糖酶再用纤维素酶水解产生的还原糖量最高。此外,采用高效液相色谱法分析了经过木聚糖酶和纤维素酶水解玉米芯粉后的产物,经过纤维素酶水解玉米芯粉的主要产物为葡萄糖、纤维二糖和木糖。木聚糖酶水解玉米芯粉的主要产物为木糖、木二糖、木三糖,只有少量的木四糖存在于木聚糖酶水解预处理玉米芯粉中。对经过水解的玉米芯粉颗粒表面进行电镜扫描观察,发现玉米芯粉通过酶水解后,其表面变得比原来更粗糙一些,颗粒径变得更小,颗粒表面上出现了一些小孔,这进一步验证了纤维素酶和木聚糖酶对玉米芯粉的水解作用非常明显。
【图文】：

玉米芯粉,硝酸钾,纯误差,总离差

Table 3.13 Analysis of variable(ANOVA) for Central Composite Designsource SS DF MS F PModel 42899.01 9 4766.56 147.09 <0.0001* 显著A-玉米芯粉 4056.47 1 4056.47 125.18 <0.0001* 显著B-硝酸钾 2534.56 1 2534.56 78.21 <0.0001* 显著C-磷酸氢二钠 83.13 1 83.13 2.57 0.1403AB 734.44 1 734.44 22.94 0.0007*AC 4.99 1 4.99 0.15 0.7029BC 2.69 1 2.69 0.083 0.7791A226604.83 1 9604.01 820.99 <0.0001*B29947.96 1 1199.21 306.98 <0.0001*C24358.31 1 0.82 134.49 <0.0001残差 324.06 10 32.41失拟项 233.59 5 46.72 2.58 0.1606 不显著纯误差 90.47 5 18.09总离差 43223.07 19

电泳图,木聚糖酶,分离纯化,电泳图

图 4.5 木聚糖酶各步分离纯化电泳图白质 Marker，Lane 1：粗酶液，Lane 2：硫酸铵盐析，Lan酶液，Lane 4：离子交换后酶液，Lane 5：凝胶过滤后酶液Figure 4.5 SDS-PAGE of xylanase purification：protein Marker，Lane 1：crude enzyme，Lane 2：ammoiumtation，Lane 3：active fraction of Desalting，Lane 4：active frion-exchange，，Lane 5：active fraction of gel filtration糖酶学性质研究聚糖酶最适温度和温度稳定性6080100酶酶%)(
【学位授予单位】：湖北工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925

【参考文献】