莲藕渣多糖的结构、免疫活性及多糖纳米硒的制备

发布时间：2020-05-08 08:25

【摘要】：莲藕是一种具有多种生物功能的水生蔬菜,其中的多糖是其生物活性成分之一,具有减肥、抗氧化、免疫调节、降血脂及降血糖等功能。Se是一种人体不可缺少的微量元素,机体的一些正常生理功能都离不开Se,但其摄入量不好控制,稍一不慎,容易因摄入过量引起中毒。纳米硒的毒性较低,且具有较好的生物活性。利用多糖作为模板制备的纳米硒,可以兼具多糖和纳米硒的生物活性,是未来食品及医药界的发展方向。本文以莲藕渣为原材料,通过水提醇沉法制备莲藕渣多糖,并对其多糖提取得率、多糖含量、硫酸根含量、糖醛酸含量、蛋白含量进行了测定,利用DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-100依次对莲藕渣多糖进行分离纯化,并对其分子量、单糖组分进行了分析,利用傅里叶红外光谱(FT-IR)、核磁共振波谱及甲基化和GC-MS对其结合方式进行了探究;然后以莲藕渣多糖刺激RAW264.7细胞构建一种体外的炎症模型,探索莲藕渣多糖对巨噬细胞MAPKs及PI3K-AKT信号通路的影响,细胞液中TNF-α、iNOS、IL-6 mRNA的表达量利用半定量RT-PCR 法检测,Akt、p-Akt、IκBα、p-IκBα、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38及核内c-fox、c-Jun水平利用免疫印记蛋白法检测:最后以分离纯化后的莲藕渣多糖为模板,利用亚硒酸钠与抗坏血酸在水溶液中的还原反应,室温下反应4 h,制备莲藕渣多糖纳米硒。探究了不同莲藕渣多糖与亚硒酸钠的摩尔比,并利用紫外全波长扫描法,结合粒度仪测其粒径的大小变化,确定了最佳的莲藕渣多糖与亚硒酸钠的摩尔比,利用SEM、TEM、XRD、FT-IR及粒度仪对莲藕渣多糖纳米硒进行了表征。主要的研究结果如下所示:(1)利用水提醇沉法制备莲藕渣多糖的得率为7.76±0.79%,多糖含量为69.19±0.24%,糖醛酸含量为1.48±0.20%,硫酸根含量为5.8±0.31%,蛋白含量为28.33±1.18mg/mL;通过测其电位及FT-IR可知,LRP为酸性多糖;凝胶渗透色谱仪测得莲藕渣多糖的分子量为1.24 kDa;GC-MS测其单糖组分主要是葡萄糖;FT-IR表明莲藕渣多糖在4000～1000 cm-1范围内有特征吸收峰;核磁共振数据进一步支持LRP通过α-糖苷键连接。(2)水提法从莲藕渣中提取莲藕渣多糖(LRP),以LRP刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型,研究莲藕多糖对巨噬细胞MAPKs及PI3K-AKT信号通路的影响。细胞液中 TNF-α iNOS、IL-6mRNA 的表达量利用半定量 RT-PCR 法检测;Akt、p-Akt、IκBα、p-IκBα、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38 及核内 c-fox、c-Jun 水平利用免疫印记蛋白法检测。结果表明,LRP没有毒性,并且可以上调相关炎症基因mRNA的表达水平,提高p38、IκBα等的磷酸化水平;使用扫描电子显微镜观察对照和LRP处理的RAW 264.7细胞的形态学变化,表明LRP可以激活RAW 264.7细胞,促进炎症反应。(3)以莲藕渣多糖为模板,利用抗坏血酸与亚硒酸钠的还原反应制备LRP-SeNPs,探究了莲藕渣多糖与亚硒酸钠溶液的摩尔比对莲藕渣多糖纳米硒粒径的影响,利用ICP测定了 LRP-SeNPs中硒的含量,双波长比色法、粒度仪、SEM、TEM、XRD对LRP-SeNPs进行表征。实验结果表明:莲藕渣多糖与亚硒酸钠溶液的摩尔比为30:1(LRP的浓度为6 mg/mL)、室温下反应4 h,可以得到性质较稳定、粒径大小约为40 nm左右的莲藕渣多糖纳米硒颗粒。由ICP可知,莲藕渣多糖纳米硒的硒含量为19.18mg/L。由SEM和TEM可知,该LRP-SeNPs较均一、分散,室温下静置一个月后的溶液仍然透明澄清,并且无聚沉、无沉淀。
【图文】：

梯度洗脱,电位,洗脱峰,氯化钠

由上图ｌ可知，０、Ｏ．ｌ邋ｍｏｌ／Ｌ的氯化钠洗脱峰较高，而０．３邋ｍｏｌ／Ｌ的氯化钠洗脱峰较矮，，逡逑说明ＬＲＰ－丨和ＬＲＰ－２的含量较多，ＬＲＰ－３的含量较少。利用粒度仪对三个组分进行测定，逡逑结果如图２所示，莲藕渣多糖去离子水洗脱峰（ＬＲＰ－ｌ）、Ｏ．ｌ邋ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ组分（ＬＲＰ－２）逡逑和０．３邋１１１0丨几的他（：１组分（０＾－３）均带有一定的负电荷，属于酸性多糖。逡逑

曲线,莲藕,梯度洗脱,多糖

图２不同梯度洗脱所得ＬＲＰ的电位（ａ－ＬＲＰ－ｌ；邋ｂ－ＬＲＰ－２；邋ｃ－ＬＲＰ－３）逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｏｆ邋ＬＲＰ邋ｏｂｔａｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｒａｄｉｅｎｔ邋ｅｌｕｔｉｏｎ邋（ａ－ＬＲＰ－１邋；邋ｂ－ＬＲＰ－２；邋ｃ－ＬＲＰ－３）逡逑如图３所示，ＬＲＰ－１、ＬＲＰ－２、ＬＲＰ－３经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００进一步分离纯化得到三个组逡逑分：ＣＬＲＰ－１、ＣＬＲＰ－２、ＣＬＲＰ－３。图中的洗脱峰均有且只有一个对称峰，表明经过分离纯逡逑化得到的莲藕渣多糖是比较纯的多糖。逡逑Ｘ＊９Ｃ邋ｎ？ａｊ逦（－■■■＊■■—逦ａｍ）逡逑３逡逑Ｌ邋Ａ邋Ｌ逡逑０邋．邋４邋，、…逦逦逦逦逦邋０．０邋＜逡逑－．ｍｒｎｍｍｆｒａｉ邋．邋ｕｉ邋．．邋．．．邋！逦Ｗ邋．．．．．．ｍｍｉ邋ｒ｜，ｒａｍｍ，邋邋%煎澹睿恚湄撸撸礤澹疱遑咤澹甆逦＊逦＇逦＇逦
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ281;TS218

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