定向改造类球红细菌提高辅酶Q10产量

发布时间：2020-05-11 08:55

【摘要】：辅酶Q10是有氧呼吸电子传递链上一个必需的辅助因子,由苯醌环和一个疏水性的类异戊二烯链共轭组成。由于其对多种疾病的治疗具有显著效果,发酵法生产辅酶Q10受到许多研究者的青睐。类球红细菌作为天然的高产辅酶Q10菌株,受到了众多研究者的追捧。由于其遗传操作体系复杂,该菌株的研究主要还集中在发酵工艺的优化和传统的诱变育种上。本研究以高产辅酶Q10的工业生产菌株类球红细菌Rhodobacte sphaeroides GY-2为研究对象,对其遗传操作体系进行了探究,成功地开发了该菌株基因组无痕编辑工具。本研究不仅有助于通过代谢途径的调控提高类球红细菌辅酶Q10的产量,同时也为改造类球红细菌生产高附加值产品的研究提供了新的思路,具有重要的理论意义与实际应用价值。1、敲除了类球红细菌R.sphaeroides GY-2的upp基因。利用改造后的自杀性质粒,敲除了类球红细菌R.sphaeroides GY-2的upp基因,获得了生产辅酶Q10新的基盘细胞R.sphaeroides GY-2 △upp。该菌株对5-FU不敏感,其生长、细胞干重、辅酶Q10产量与工业菌株无显著差异,回补了谷氨酸棒杆菌的upp基因后,又恢复了对5-FU敏感性。2、建立了以自杀性质粒pSUP202介导基于upp反向筛选标记的基因组无痕编辑工具。利用此工具,成功地敲除了编码分支酸变位酶的Cm基因,得到了双基因敲除菌株R.sphaeroidesGY-2 △upp△Cm。与出发菌株相比,R.sphaeroides GY-2△upp△Cm菌株辅酶Q10产量提高了 15.3%,辅酶Q10的产率提高了20.4%,生物量无明显变化。同时检测到R.sphaeroidesGY-2 △uppACm菌株发酵液上清中积累了0.5mM的pHBA。3、利用建立的基因编辑方法,获得了R.Shaeroides GY-2 △upp-crtA::ubiG和R.Sphaeroides GY-2△upp-crtD::ubiE的突变菌株。R.Sphaeroides GY-2 △upp-crtA::ubiG重组菌株的辅酶Q10产量相比出发菌株R.Sphaeroides GY-2 Aupp提高了 11.39%,辅酶Q10的产率提高了 13.1%,生物量无明显变化。而R.Sphaeroides GY-2△upp-crtD::ubiE重组菌株相比出发菌株R.Sphaeroides GY-2△upp辅酶Q10产量,辅酶Q10的产率和生物量均无明显变化。
【图文】：

３类球红细菌中辅酶Ｑ１０的生物合成途径逡逑辅酶Ｑ１０的生物合成途径主要有三部分组成：苯醌环的合成、多聚异戊二烯焦逡逑磷酸侧链的合成以及苯醌环的修饰［２】（见图２）。在真核生物与原核生物中苯醌环的逡逑来源途径不同。在原核生物内醌环的前体是对羟基苯甲酸，对羟基苯甲酸是由莽草逡逑酸途径产生的。莽草酸途径产生的分支酸是原核生物合成芳香族氨基酸的重要中间逡逑物，其中产生的分支酸经ｗＷＣ基因编码的分支酸丙酮酸裂解酶催化生成对羟基苯甲逡逑酸。而大部分的真核生物内是没有莽草酸途径的，这就必须依靠生物体内的必需氨逡逑基酸酪氨酸来合成苯醌环。酿酒酵母作为低等真菌，其对羟基苯甲酸可由莽草酸途逡逑径和酪氨酸两种方式合成。此外，所有的多聚异戊二烯焦磷酸侧链都是由两个重要逡逑的五碳化合物，异戊烯焦磷酸（ＩＰＰ）和其同分异构体二甲基丙烯基焦磷酸（ＤＭＡＰＰ）逡逑组成的。不同的生物体内ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ的合成途径不同，在真细菌、绿藻和植物逡逑的叶绿体中

类球红细菌中苯醌环的前体物质为对羟基苯甲酸，，首先由莽草酸途径产生的分逡逑支酸经基因编码的分支酸丙酮酸裂解酶催化形成对羟基苯甲酸，然后再进一步逡逑异戊烯化以及对苯醌环的修饰（图３）。莽草酸途径作为芳香族氨基酸合成的关键逡逑途径，其中间产物分支酸一方面经分支酸丙酮酸裂解酶催化形成对羟基苯甲酸；逡逑方面由分支酸变位酶（Ｃｍ）催化形成预苯酸
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.6

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本文编号：2658209