RNA结合蛋白HuR在结直肠癌中对CREPT蛋白表达影响的研究

发布时间：2020-05-14 07:37

【摘要】：肿瘤细胞周期相关及表达上调蛋白(Cell-cycle-Related and Expression Elevated Protein in Tumor,CREPT,Gene ID:58490)一种新发现的在肿瘤发生过程中增强细胞增殖的人类肿瘤相关蛋白,在大多数肿瘤中被证实存在过表达。而CREPT基因本身表达水平在肿瘤组织中升高的分子机制尚不清楚。人抗原R(Human antigen R,HuR)是一种RNA结合蛋白,其与某些基因mRNA的3′非编码区(3′UTR)中的富含AU的元件(AU-rich element,ARE)结合,可稳定mRNA并调节其翻译。CREPT mRNA具有较长的3′UTR区,为多种RNA结合蛋白及miRNAs的结合提供了广泛的结合位点。本研究在明确HuR对CREPT表达存在调控的基础上,进一步分析了miR-383与HuR对CREPT表达的共调控作用,为结直肠癌发生的分子机制奠定理论基础。在本研究中,利用Western Blot实验,研究HuR对CREPT蛋白水平表达调控,发现HuR可正向调控CREPT表达。观察到HuR敲降可使CREPT的表达在结肠癌细胞中下调;Western Blot、RT-PCR实验结果发现HuR过表达上调了CREPT在mRNA和蛋白水平的表达。通过RNA-IP实验发现HuR和CREPT mRNA存在直接相互作用,进一步使用荧光素酶报告基因检测,发现HuR直接靶向CREPT mRNA的3′-UTR特定位点。在此基础上,进一步明确HuR和miR-383共同调节CREPT的表达。此外,通过CCK-8法、细胞划痕、克隆形成实验,系统研究了HuR对结直肠癌细胞HCT116β/ω增殖、细胞迁移、克隆形成能力的影响。通过流式细胞仪检测,对HuR对细胞周期和凋亡的影响进行探究。结果表明,HuR促进了结肠癌细胞的细胞增殖和集落形成,并且促使细胞周期快速进入G_2/M期,同时抑制了细胞凋亡。本研究证明了HuR在结肠癌细胞中的稳定过表达促进了结直肠癌的生长。研究结果显示,CREPT在结直肠癌中的高表达归因于HuR水平过表达。系统探索了RNA结合蛋白HuR对CREPT mRNA的调控机制,揭示其在结直肠癌的发生、发展过程中发挥着重要作用。综合探索了HuR与miR-383对CREPT蛋白的研究,揭示了结直肠癌发生的分子机制并为新型靶向性药物发现奠定基础。
【图文】：

线图,实验路,线图,结直肠癌

再利用 Western Blot、RT-PCR、Luciferase Assay 及定点突变技术对 HuR、CREPT进行蛋白水平及 mRNA 水平检测，确定 HuR 对 CREPT 蛋白表达的调控作用并确定其可能调控位点。通过 CCK-8 法、克隆形成等实验，系统探索了 HuR 蛋白对结直肠癌细胞增殖、克隆形成能力的影响。通过流式细胞术，研究了 HuR 对细胞周期的影响。本论文第 2 章通过 Western Blot 实验和 RT-PCR 实验，首先明确 CREPT 表达量中等的结直肠癌细胞株，有利于后续对其表达机制的研究。利用转染实验，，在筛选出的结直肠癌细胞株中转染系列 HuR siRNAs 的基础上，通过 Western Blot、RT-PCR确定可以高效敲降 HuR 的 siRNA。利用 ARE site 位点预测、LuciferaseAssay 和定点突变确定HuR 蛋白与CREPT mRNA可能的结合位点。第3章通过转染实验探究 HuR对结直肠癌细胞株增殖、克隆形成、转移和细胞周期的影响。在前面研究基础上，第 4 章系统探索了 HuR 和 miR-383 共同对 CREPT 蛋白水平、mRNA 水平的影响，并进行了一系列细胞功能实验，确定了 miR-383 与 HuR 共调控 CREPT 表达。

柱状图,结直肠癌,过表达,蛋白

CREPT 蛋白在 HuR 过表达或敲降条件下的蛋白表达的柱状图（注：与 CMV6 组相比，**P<0.01，***P<0.001；与 NC-siRNA 组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001）实验结果如图 2-3A、B 所示，与 NC-siRNA 对照组相比，CREPT 蛋白在 HuRsiRNA 处理组表达量显著降低；与 CMV6 对照组相比，CMV6-HuR 转染组 CREPT蛋白的表达量显著增多（P<0.01）。Elisa 实验结果与蛋白印迹结果相一致（图 2-3C）。上述实验结果说明，在 HuR 蛋白过表达的情况下，CREPT 蛋白的表达也随之显著提高，说明 HuR 在结直肠癌细胞株中对 CREPT 蛋白表达存在调控作用。2.4.4 HuR对结直肠癌细胞中CREPT mRNA表达的调控作用为了进一步验证 si-HuR 是否是作用于 CREPT，并抑制 CREPT mRNA 表达，我们进一步利用 Lipofectamine2000 转染试剂分别将 NC-siRNA、si-HuR、CMV6、CMV6-HuR 质粒转染至结直肠癌细胞株 HCT116β/ω，48 h 后检测各备选 siRNA 及过表达质粒对 CREPT mRNA 表达影响。通过 RNA 提取、逆转录、PCR 反应及琼脂糖凝胶电泳等一系列实验检测结直肠癌中 CREPT mRNA 的表达。
【学位授予单位】：燕山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ460.1

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