酿酒酵母对糠醛耐受性的数量性状定位

发布时间：2020-05-15 19:02

【摘要】：目前利用酿酒酵母降解木质纤维素生产燃料乙醇已得到全面商业化生产。然而,木质纤维素在水解过程中会产生复杂抑制物对酿酒酵母生长及发酵产乙醇造成不利的影响。糠醛是其中主要抑制物之一,能诱导活性氧(ROS)的积累,各种代谢通路关键酶活性降低,最终导致细胞程序性衰亡。目前主要集中在利用反向遗传学(基因变化研究表型变化)来发现可能与耐受抑制剂相关响应代谢途径的基因及转录调控因子,并对微生物进行改造(过表达或敲除)来提高耐受性,但是关于酵母糠醛耐受性表型的系统全基因组分析还未得到验证及完全明确的解析,同时部分都是以实验菌株为研究对象,而工业酿酒酵母的遗传结构更为复杂。因此,本研究从分子生态学及正向遗传学(从天然表型变化研究基因本质变化)角度来深入分析酿酒酵母的糠醛耐受性机制,同时为其他纤维素抑制剂耐受性的研究提供有效可行的方法。本文以48株工业酿酒酵母为出发菌株,进行不同浓度糠醛耐受性的表型测定,最大表型值达到21 mmol·L~(-1),最小表型值达到5 mmol·L~(-1),大部分菌株的表型值处在 15 mmol·L~(-1)~17 mmol·L~(-1)。由于工业酿酒酵母存在产孢能力退化问题,选择了表型值为21 mmol·L~(-1) CICC 31144(二倍体)作为抗性亲本,11 mmol·L~(-1) CICC 1373(二倍体)作为敏感菌株。在McClary产孢培养基上进行生孢实验分析两株菌的产孢能力,CICC31144产孢率在41%±0.12%,而CICC 1373产孢率在55%±0.17%。利用PCR技术快速鉴定单倍体交配型并表型筛选及HO基因敲除,成功获得表型值21 mmol·L~(-1)作为高耐糠醛菌株(CICC 31144-MAT-a)亲本P1,一株表型值为11 mmol·L~(-1)作为低耐糠醛菌株(CICC 1373-MAT-α)亲本P2。亲本菌株杂交构建大量子代群体用于遗传作图,利用SPSS 19.0软件对200株F2代群体进行糠醛耐受性表型分布进行描述性统计分析,偏度系数为㧟0.375,峰度系数为0.238,二者系数小于1,近似正态分布,说明糠醛耐受性状是传统连续性数量性状,并适用于数量遗传学研究。将已有的微卫星(SSR)位点(190个)在两株亲本单倍体菌株间基因分型,筛选出来具有多态性的位点共82个,多态性比例在43%。利用这些多态性位点对分布在两极端F2代群体(39株)基因分型并进行基因型均值差异分析,发现两个与糠醛耐受性相关微卫星位点,其中2P3位点达到显著差异,而2P5位点达到极显著差异,耐受亲本P1的2P5基因型(333 bp)在子代耐受群体中出现率为72.2%,而敏感亲本P2的基因型(318 bp)在子代敏感群体中出现率达100%(333 bp出现率为零),说明2P5位点可能与控制该性状的QTL具有极显著连锁遗传关系。利用Kosambi函数构建遗传图谱,79个总标记数,14个连锁群,总长度1499.07 cM。利用完备区间作图(ICIM)对糠醛耐受性数量性状定位,LOD曲线在2号、7号、16号染色体上存在明显的峰值,表型变异率分别为43.1%、28.65%、12.34%,其中qTCHRII是位于2号染色体2P5与2P6之间(205476~258897),qTCHRVII是位于7号染色体上7P17与7P14之间(1043692~156030),qTCHRXVI是位于16P16与16P17之间(591668~834952),2号、7号染色体表型变异率较高,该区间是影响糠醛耐受性的主效QTL。本研究建立密度合适的遗传图谱对酿酒酵母糠醛耐受性数量性状初步定位,为进一步精确定位以及选择有利等位基因(分子标记辅助育种MAS),提高育种的准确性和预见性奠下基础。
【图文】：

原料预处理,木质纤维素,抑制物,甲基乙二醛

第一章绪论）、乙醛脱氢酶（ALD4P，ALD6P）、乙醛还原酶（ARI1P）、甲基乙二醛2P，GRE3P）[16-19]。Li 等通过转录组分析发现一个新型编码醛还原L131W，并利用 YEASTRACT 数据库对其序列分析，Yap1p、Msn2/4p、PRpn4p 转录调控因子诱导 YML131W 表达，其中 Yap1p、Msn2/4p、Pdr1胁迫应激反应[20, 21]。

降解模式,糠醛,抑制物

因此在提高耐受性方面的研究逐渐引起关注，如图1-2 所示，糠醛在低浓度下，酿酒酵母具有原位脱毒的作用，依赖于辅酶 NADH 醛还原酶降解糠醛并转化为低毒性糠醇，减少了磷酸二羟丙酮的转化从而减少了甘油的生成，使得碳的代谢流向乙醇的生成，得率提高[14]；但是高浓度的糠醛代谢使得 NADH 消耗过大，乙醇脱氢酶的活性被抑制，导致在酵母细胞内的乙醛含量上升，菌体生长受到抑制，乙醇产率下降，同时能诱导活性氧（ROS）的积累，引起线粒体、液泡膜、肌动蛋白骨架和染色质严重损害，各种代谢通路关键酶活性降低，从而抑制微生物的生长[15]。根据以往对糠醛耐受性机制研究进展来看，酿酒酵母将糠醛浓度降低同时转化为较低毒性的糠醇过程需要多种相关脱氢酶和还原酶的参与，包括乙醇脱氢酶（ADH6P，ADH7P，，
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ223.122;TQ926

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