GlmS酶活力改造及对大肠杆菌产氨基葡萄糖的影响研究

发布时间：2020-05-19 22:56

【摘要】：所有的生物中氨基葡萄糖(GlcN)都是必不可少的,其中包括细菌、真菌、植物以及动物。GlcN是糖蛋白、壳聚糖和甲壳素的主要组成成分。氨基葡萄糖合成酶(GlmS)将果糖-6-磷酸和谷氨酰胺转化为氨基葡萄糖-6-磷酸和谷氨酸。GlmS在大肠杆菌中的过表达增加了氨基葡萄糖-6-磷酸的合成,氨基葡萄糖-6-磷酸被脱磷酸化并以氨基葡萄糖的形式分泌到生长培养基中。本实验使用PCR介导的定点饱和突变对大肠杆菌glmS基因进行改造,以开发出适合发酵生产氨基葡萄糖的微生物菌株。氨基葡萄糖合酶(GlmS)过表达可以提高氨基葡萄糖的产量。将枯草芽孢杆菌中的氨基葡萄糖合酶基因(glmS),连接到表达载体pET-28a上得到重组质粒pET-28a-glmS,然后将重组质粒转化到E.coli BL21感受态细胞中,成功构建了在发酵过程中氨基葡萄糖产量明显增加的工程菌E.coli BL21-pET-28a-glmS。对构建的工程菌进行摇瓶发酵,当发酵16 h时,发酵液中氨基葡萄糖产量达到最高为1.01 g/L。对GlmS进行了酶学性质的测定,其最适反应温度为37℃,最适反应pH为7.5。通过计算机模拟分析预测氨基葡萄糖合酶空间结构,理性分析选取保守性低的氨基酸位点,然后根据glmS序列设计突变引物对构建的质粒pET-28a-glmS进行PCR介导的全质粒定点饱和突变。将获得的突变质粒转化到E.coli BL21感受态细胞中,诱导表达。通过检测氨基葡萄糖合酶的活性,筛选得到了四株(L601H、A602C、K603T、S604G)比原始酶酶活提高的菌株,其酶活分别提高了43.3%、34.6%、55.3%及50%。对突变型氨基葡萄糖合酶进行酶学性质的测定,发现其最适的反应温度为37℃,最适反应pH为7.5。使用菌株E.coli BL21、E.coli BL21-pET-28a-glmS、突变菌L601H、A602C、K603T、S604G进行了发酵实验。筛选得到优化的发酵培养基:葡萄糖浓度为50 g/L、蛋白胨浓度为10 g/L、酵母浸粉浓度为20 g/L、MnCl_2浓度为20 mg/L。通过摇瓶发酵检测发酵液中GlcN的产量,L601H的发酵液中的GlcN产量达到1.45 g/L。A602C的发酵液中GlcN产量达到1.3 g/L。K603T的发酵液中GlcN产量达到1.1 g/L。S604G的发酵液中GlcN产量量达到1.0 g/L。
【图文】：

大肠杆菌氨基葡萄糖代谢途径Fig.1.1GlucosaminemetabolicpathwayinE.coli

实验流程图
【学位授予单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6

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本文编号：2671609