初探酵母MF-Y11转化γ-癸内酯的环化机制

发布时间：2020-05-20 20:05

【摘要】：γ-癸内酯是一种具有桃子和杏风味的内酯类化合物。其可通过酵母菌,以蓖麻油、蓖麻油酸或蓖麻油酸甲酯为底物来生物合成。蓖麻油酸在酵母菌胞内通过β-氧化得到γ-癸内酯的重要前体物4-羟基癸酸,4-羟基癸酸又在环化酶的作用下进一步环化为γ-癸内酯。本论文通过化学合成的方法制备出γ-癸内酯的直接前体物4-羟基癸酸,并以合成的4-羟基癸酸作为酵母MF-Y11发酵的底物,通过研究在不同因素下发酵过程中产物γ-癸内酯、底物4-羟基癸酸和发酵液pH的变化规律,初步阐明内酯环化酶转化4-羟基癸酸为γ-癸内酯的环化机制。具体内容有以下几方面:第一,通过氢氧化钠将γ-癸内酯进行皂化,再用D113弱酸阳离子树脂进行离子交换进行酸化,获得了纯度为98.7%,收率为32.0%的4-羟基癸酸。并对其进行了衍生化质谱、红外光谱和核磁共振波谱的表征,确定了其化学结构,并对4-羟基癸酸的一些理化性质进行了补充完善。得出4-羟基癸酸在常温下开始自发环化的上限pH值是5.03,下限pH值是1.93;4-羟基癸酸在加热的条件下,开始自发环化的下限温度值是42℃(熔点),上限温度是150℃,并在此基础上建立了该体系4-羟基癸酸的分析方法。第二,通过对发酵过程中酵母MF-Y11转化4-羟基癸酸发酵过程参数的优化,得出最适的转化条件为培养基起始pH7.50、转化温度30℃,最适底物加入量为2.00g/L,在此条件γ-癸内酯浓度达到最大值为0.50g/L,并得出酵母MF-Y11中环化酶不再有活性的pH值为4.82。得知4-羟基癸酸环化酶的最大热半衰期为4.41h,最大热失活速率常数为0.16h~(-1)。通过研究最适条件下酵母MF-Y11胞内环化酶的反应动力学曲线,推测该酶可能是别构酶,并计算出了发酵动力学参数V_(max)=0.48mmoL·L~(-1)h~(-1)(0.060g·L~(-1)h~(-1)),K_m=5.05 mmoL·L~(-1)(0.91g L~(-1))。第三,通过对酵母在不同因素影响下4-羟基癸酸的发酵动力学和代谢流进行分析,得出低浓度的4-羟基癸酸具有向γ-癸内酯更高的转化效率。其中对4-羟基癸酸环化能力起到促进作用的金属离子,其能力由大到小排序为Mg~(2+)Ca~(2+)Zn~(2+)。并通过多个角度的验证,进一步得出γ-癸内酯对该酵母的抑制浓度在该体系最适条件下为0.50g/L左右。第四,通过研究发现,在上述4-羟基癸酸环化酶的最适条件下,通过采用对酵母毒性小的非水溶性有机溶剂DC345进行原位分离,使的酵母MF-Y11转化15.00g/L的12-羟基硬脂酸在72hγ-癸内酯的产量可达到2.25g/L,特别的该酵母转化3.00g/L的12-羟基硬脂酸在24hγ-癸内酯的摩尔转化率可以达到81%,比不加入DC345提高了3.63倍。本论文通过对酵母MF-Y11转化γ-癸内酯的环化机制进行初探,为γ-癸内酯的产业化提供了理论基础,提供了一种新的制备γ-癸内酯方法,使其工业化成为可能。
【图文】：

流量的进样方式，，柱流速为 1mL/min,检测器；其中进样口为 250℃，检测器 120℃保持 2 min，然后 30 ℃/min 升温2min。采用外标法定量，保留时间为 5艺流程简图士学位论文 1、甲醇和水2、90℃搅拌 16h4-羟基癸酸钠/甲4-羟基癸酸钠（s）、加水1、D113 树脂2、冰水浴结晶癸酸（s）图 2.2 4-羟基癸酸制备工艺流程简图Process flow diagram for synthesis of 4- hydrox

点 A10-羟基癸酸，Rf=0decanoic acid (spot A 10-hyroxy decanoic acid, Rf= 0.7气相质谱联用（GC-M方法，样品处理条件是，用基硅烷咪唑（TMSI）,在活泼氢进行三甲基硅烷 有机滤膜过滤到气相分GC-MS ）分析条件为柱载气为 He。选择恒1uL。检测器为离子火焰温程序为：初始温度 1 250℃，继续保持 10m80℃。））
【学位授予单位】：上海应用技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.1

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本文编号：2673131