米曲霉来源β-半乳糖苷酶的分子改造及其制备低聚半乳糖的研究
发布时间：2020-05-21 12:35
【摘要】：低聚半乳糖(GOS)是一类益生效果良好的低聚糖,被广泛应用于食品和保健品行业。工业上一般采用β-半乳糖苷酶催化乳糖获得。目前,日本拥有比较成熟的工业生产技术,年产量也居于世界首位,而国内由于欠缺性能较好的β-半乳糖苷酶、生产技术落后等原因,目前对GOS的生产还处于落后水平。本研究将米曲霉(Aspergillus oryzae RIB40)来源的β-半乳糖苷酶连接到表达载体pPIC9K上,并将重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris KM71),获得了能够表达β-半乳糖苷酶的重组菌。通过定点突变的方法获得了三株转苷能力提升的突变体,并对突变体及野生型酶生产GOS的反应条件进行了优化,对转苷能力最高的双突变体N140C/W806进行了3 L罐发酵,最后分析了突变体产生效果的原因,并对原因进行了验证。主要研究结果如下:(1)将米曲霉来源的β-半乳糖苷酶基因连接表达载体,转入Pichia pastoris KM71,获得能够高效表达β-半乳糖苷酶的重组菌,摇瓶酶活达到198.7 U·mL~(-1),对野生型基因进行定点突变,获得了多株转苷能力提升的突变株。对突变体动力学参数进行分析,其中,N140C及N140C/W806F突变体对乳糖的K_m值比野生型酶有所提高,说明两个突变体对乳糖亲和力下降,水解活性降低,符合实验预期。(2)对突变体及野生型酶生产GOS的条件进行了优化。两个单突变体生产GOS的能力均比野生型有所提高,其中W806F突变体在最优条件下生产GOS的产率达到49.3%,N140C单突变体最优条件下生产GOS的产率达到50.7%,比野生型酶分别提高了35.2%及31.5%。双突变体N140C/W806F的最佳反应条件:乳糖浓度600 g·L~(-1)、加酶量2.5U·mL~(-1)、反应温度为40℃,反应pH 4.5,反应时间7 h。其最终产率为59.8%,比野生型提高了59.2%。对双突变体N140C/W806F进行了3 L罐发酵优化,确定最佳诱导温度为28℃,此时双突变体酶活达到65.3 U·mL~(-1),比摇瓶提高4.44倍。(3)对突变体产生效果的原因进行了分析,认为N140C突变点氨基酸残基的改变导致半乳糖基氢键的破坏,从而影响水解反应和转苷反应,使得转苷反应相对占据优势,进而最终提高产率。W806F突变产生的效果与此位置疏水性增加有关,疏水性增强降低了水作为受体参与反应的机会,相应的糖基作为受体的反应得到增强,从而提高转苷能力。设计正向突变N140A以及反向突变W806H,其中N140A突变后,生产GOS的产率达到44.9%,比野生型高19.7%,W806H生产GOS产率为22.7%,比野生型降低,成功验证了我们对突变产生效果原因的推测。
【图文】：
第一章 绪论1.1 β-半乳糖苷酶概述1.1.1 β-半乳糖苷酶的来源β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase, EC 3.2.1.23)，也称乳糖酶，具有水解乳糖的作用，能够将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖[1]，通常在乳制品行业中用来降低乳制品中乳糖含量，解决乳糖不耐症；除了水解乳糖外，β-半乳糖苷酶还具有转苷能力，，可以利用乳糖合成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶在自然界中广泛存在，不仅存在于细菌、真菌、霉菌等常见微生物中，而且在动物的皮肤和肠道组织[2-4]、植物的叶茎种子[5-7]也广泛存在。其中，对微生物来源的 β-半乳糖苷酶研究最为广泛[1, 7-9]。目前市场上商品化的 β-半乳糖苷酶有很多，具体如表 1.1 所示。表 1.1 商业性的 β-半乳糖苷酶来源Table 1.1 Commercial sources of some β-galactosidase
图 1-1 β-半乳糖苷酶催化合成 GOS 机制Fig. 1-1 β-galactosidase catalyzes the synthesis of GOS1.1.3 不同来源 β-半乳糖苷酶的性质比较不同来源的 β-半乳糖苷酶性质各异，正是这种性质的多样性大大提高了其在食品工业的应用。尽管不同来源 β-半乳糖苷酶的应用很广，但对于生产低聚半乳糖来说，真菌来源的 β-半乳糖苷酶却一直占据着主导地位。其中，作为食品安全菌的曲霉以及克鲁维酵母属来源的β-半乳糖苷酶的研究最为广泛。例如，Dragosits等研究了Aspergillus nidulan以及 Aspergillus niger 的生物应用及糖学应用[12]，Frezel 等比较了米曲霉、棘孢曲霉以及克鲁维乳酸菌来源的 β-半乳糖苷酶的转苷能力[13]。除了具有食品安全菌的优良特性外，反应pH偏酸性也是真菌来源β-半乳糖苷酶的优势。例如，Kluyveromyces fragilis和A. nige来源的 β-半乳糖苷酶最适 pH 为 4.0 4.5 ，并且在 pH 3.0 7.0 之间稳定性都比较好，最适温度为 55℃，比较适用于酸性乳酪中乳糖的水解[14]。Isobe 等从温泉中分离出Teratosphaeria acidotherma AIU BGA-1，发现其来源的 β-半乳糖苷酶能够在酸性到中性pH 范围内均保持很高的活性[15]。另外，对真菌来源的 β-半乳糖苷酶的定向进化以及晶体
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ925;TQ281
【图文】：
第一章 绪论1.1 β-半乳糖苷酶概述1.1.1 β-半乳糖苷酶的来源β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase, EC 3.2.1.23)，也称乳糖酶，具有水解乳糖的作用，能够将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖[1]，通常在乳制品行业中用来降低乳制品中乳糖含量，解决乳糖不耐症；除了水解乳糖外，β-半乳糖苷酶还具有转苷能力，，可以利用乳糖合成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶在自然界中广泛存在，不仅存在于细菌、真菌、霉菌等常见微生物中，而且在动物的皮肤和肠道组织[2-4]、植物的叶茎种子[5-7]也广泛存在。其中，对微生物来源的 β-半乳糖苷酶研究最为广泛[1, 7-9]。目前市场上商品化的 β-半乳糖苷酶有很多，具体如表 1.1 所示。表 1.1 商业性的 β-半乳糖苷酶来源Table 1.1 Commercial sources of some β-galactosidase
图 1-1 β-半乳糖苷酶催化合成 GOS 机制Fig. 1-1 β-galactosidase catalyzes the synthesis of GOS1.1.3 不同来源 β-半乳糖苷酶的性质比较不同来源的 β-半乳糖苷酶性质各异，正是这种性质的多样性大大提高了其在食品工业的应用。尽管不同来源 β-半乳糖苷酶的应用很广，但对于生产低聚半乳糖来说，真菌来源的 β-半乳糖苷酶却一直占据着主导地位。其中，作为食品安全菌的曲霉以及克鲁维酵母属来源的β-半乳糖苷酶的研究最为广泛。例如，Dragosits等研究了Aspergillus nidulan以及 Aspergillus niger 的生物应用及糖学应用[12]，Frezel 等比较了米曲霉、棘孢曲霉以及克鲁维乳酸菌来源的 β-半乳糖苷酶的转苷能力[13]。除了具有食品安全菌的优良特性外，反应pH偏酸性也是真菌来源β-半乳糖苷酶的优势。例如，Kluyveromyces fragilis和A. nige来源的 β-半乳糖苷酶最适 pH 为 4.0 4.5 ，并且在 pH 3.0 7.0 之间稳定性都比较好，最适温度为 55℃，比较适用于酸性乳酪中乳糖的水解[14]。Isobe 等从温泉中分离出Teratosphaeria acidotherma AIU BGA-1，发现其来源的 β-半乳糖苷酶能够在酸性到中性pH 范围内均保持很高的活性[15]。另外，对真菌来源的 β-半乳糖苷酶的定向进化以及晶体
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ925;TQ281
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本文编号：2674307
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