连翘花美白物质基础初步研究

发布时间：2020-05-21 10:35

【摘要】：连翘花为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)vahl的干燥花。连翘作为山西的道地药材,传统以果实入药,其花通常被弃用,造成很大程度上的资源浪费。本实验室的前期研究工作显示,连翘花具有美白功效。因此,为了充分利用连翘花资源和探究连翘花美白物质基础,本文首先对连翘花的质量控制标准进行了研究,为有效控制化妆品原料的质量一致性提供依据;在此基础上以酪氨酸酶为作用靶点,分别在分子水平和细胞水平对连翘花提取物进行了抑酶作用的研究,探讨并寻找抑酶有效部位和活性成分。进一步研究了连翘花提取物抑酶有效部位的制备工艺,并测定了有效部位化学成分的含量,以期为连翘花作为天然的美白剂应用于化妆品行业提供理论依据。实验内容如下:1.对7批连翘花进行标准研究,包括检查项(水分和总灰分)、浸出物量、指标性成分含量测定及特征图谱的建立等。根据2015版《中国药典》的测定方法,水分的检查按照附录IXH项下烘干法,拟定水分含量不得超过10%;总灰分的检查按照附录IXK项方法,拟定总灰分含量不得超过7%;浸出物按照附录X项方法,拟定浸出物含量不得少于28%。建立HPLC方法测定连翘花中连翘酯苷A、芦丁、连翘苷含量,根据实验结果拟定了连翘花指标性成分的含量最低限量,即连翘酯苷A的含量不得低于3.0%,芦丁的含量不得低于2.7%,连翘苷的含量不得低于0.8%。利用HPLC法建立连翘花的特征图谱,根据对7批样品的测定分析,拟定特征图谱中的共有峰(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁和连翘苷作为连翘花特征峰。2.采用大孔树脂D101柱对连翘花水提物进行粗分离,得到H-1、H-2、H-3、H-4、H-5五个组分;首先在分子水平对连翘花粗提物及五个洗脱部位进行抑制蘑菇酪氨酸酶活性的筛选。实验结果表明:连翘花的粗提物体现出对酪氨酸酶活性具有抑制作用,且在实验浓度范围内随着药物浓度的增大,抑制率呈上升趋势。其中,H-3部位表现出较强的抑制作用,其IC_(50)为0.82 mg/mL与阳性对照物熊果苷相近。进一步在细胞水平进行验证,H-3部位对细胞内酪氨酸酶活性亦有较强的抑制作用,同时其产生的黑色素含量最低。因此,有效部位H-3可能是一种潜在的黑色素合成抑制剂。3.利用凝胶柱层析与制备型高效液相色谱对H-3有效部位进行成分分离鉴定,分离得到5个化合物。其中通过HPLC分析及标准品比对确定了3个化合物,分别为(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁。此外,利用核磁共振~(13)C NMR及标准品比对确定另2个化合物分别为异连翘酯苷和连翘酯苷H。进一步在分子水平和细胞水平上,对分离得到5个成分进行了抑制酪氨酸酶酶活力测试。实验结果显示异连翘酯苷和连翘酯苷A对酪氨酸酶酶活抑制能力最强,同时对细胞内的黑色素合成具有较强抑制率。据此推测异连翘酯苷和连翘酯苷A是抑酶作用的主要成分。4.通过大孔树脂对H-3有效部位进行中压制备工艺研究。方法:以有效部位内5种指标成分(异连翘酯苷、(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷H、连翘酯苷A、芦丁)的HPLC图谱分析为依据,考察了样品上样量和洗脱体积。并对洗脱物进行得率及抑酶实验的测定。最终确定大孔树脂中压制备工艺的最佳条件为:柱材料为95 g,上样浓度为200 mg/mL,洗脱流速为20 mL/min时,上样量为14 g,弃去1.6 L水洗脱液和1.6 L 20%乙醇洗脱液,收集2.4 L 40%乙醇洗脱液并减压浓缩干燥,得到H-3部位。为后续有效部位的中试工艺规模生产提供科学有效的方法。5.采用HPLC色谱法对5批H-3有效部位样品中已确认的5种成分的含量进行测定。结果显示,5批样品中5种成分的总含量均达到H-3有效部位含量的50%,且RSD=3.97%,说明该制备方法得到的样品质量相对稳定可靠。
【图文】：

连翘花,样品,色谱峰

第二章连翘花标准初步研究1-4 号色谱峰为共有峰，，且峰面积相对较大。所以，将这 4 个峰作为连翘花特征图谱中的特征峰。根据上述 7 批样品的测定结果，选择各批样品均具有的主要色谱峰作为对照特征图谱（如图 2.2A），将实验室标准品溶液在相同的色谱条件下进样分析（如图 2.2B），并与连翘花特征图谱中的色谱峰的保留时间进行对比，最终确定图谱峰中的峰 1 为(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、峰 2 为连翘酯苷 A、峰 3 为芦丁、峰 4 为连翘苷。2

连翘花,对照特征,特征峰,图谱

图 2.2 连翘花对照特征图谱及其特征峰指认Fig 2.2 F.suspensa flower comparison feature map and its characteristic peak identification峰 1 为(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷((+)-pinoresinol-β-D-glucopyranoside)；峰 2为连翘酯苷 A(forsythiaside A)；峰 3 为芦丁(rutin)；峰 4 为连翘苷(philliyrin)图 A 为连翘花样品图谱图 B 为标准品图谱小结1．对 7 批连翘花进行标准研究，包括检查项（水分和总灰分）、浸出物量、指成分含量测定及特征图谱的建立等。根据 2015 版《中国药典》的测定方法，水检查按照附录 IXH 项下烘干法，拟定水分含量不得超过 10%；总灰分的检查按录 IXK 项方法，拟定总灰分含量不得超过 7%；浸出物按照附录 X 项方法，拟出物含量不得少于 28%。不同产地的药材检查项及浸出物含量之间的差异可能材的地域有关，还可能与预处理方式和采收期（花蕾期、盛花期、结果期）等。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ658

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