粘质沙雷氏菌外膜磷脂酶A（A1）基因克

发布时间：2020-05-21 23:30

【摘要】：化学精炼植物油的目的是为了除去会对成品油的质量和保质期造成不良影响的杂质。然而,考虑到对环境的影响和经济效益,物理精炼方法的使用正在增加。酶促脱胶则是一种能够达到物理精炼油要求的脱胶方法,但磷脂酶的生产高成本和低效率局限了其应用。同时,用于脱胶的磷脂酶不能被回收和再次利用也大大提高了酶法脱胶的工业化应用成本。本研究克隆外膜磷脂酶A1基因,构建原核和真核表达载体,实现其在原核和真核表达体系中的异源表达,研究了其酶学特性与固定化过程,并将其应用于粗菜籽油的酶法脱胶中,为开发新型磷脂酶和改进脱胶技术提出了一种有效可行的方法,主要结果如下:(1)外膜磷脂酶A1基因克隆及生物信息学分析。将粘质沙雷氏菌总基因组当模板,PCR扩增得到目的基因,构建pEASY-OM-PLA1,转入E.coil DH5α,抽取质粒测序验证并分析。该基因与Serratia marcescens subsp.marcescens Db11同源性为99.55%。进化树结果显示,该基因所产OM-PLA1与来源于大肠杆菌NC_000913.3的OM-PLA1表现出最高的同源性。该蛋白分子式为C_(1513)H_(2249)N_(411)O_(449)S_6,相对分子质量为33572.34,是稳定亲水性蛋白,含有信号肽,为胞外分泌蛋白,蛋白二级结构中α-螺旋占15.75%,β-折叠占36.64%,无规则卷曲占47.60%且不含有非常规二级结构,三级结构显示每个单体为β-桶状结构。(2)重组大肠杆菌构建、酶学特性及酶法脱胶。将pEASY-OM-PLA1转入E.coil BL21(DE3)中,外膜磷脂酶A1的活性在诱导4 h和IPTG浓度0.6 mmol/L的条件下最大化。重组蛋白经Ni~(2+)柱纯化后SDS-PAGE检测显示,有一分子量约为33 KDa的特异性条带。酶学性质研究结果显示,其最适pH和最适温度分别为7.5和50℃,在pH 7.0-8.0和45-55℃内其稳定性较好,酶动力学参数为Km=31.954mM,Vmax=1.5056 mM/min,0.1 mmol/L的Ca~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)溶液能显著提高其酶活力,1 mmol/L的Cu~(2+)、Zn~(2+)、SDS、EDTA、EGTA溶液则显著抑制了其酶活力。用于粗菜籽油脱胶,当酶添加量为15 U和脱胶时间为2 h时,脱胶油样中的磷含量值均从22.6 mg/kg降低至10 mg/kg以下。(3)重组毕赤酵母构建及诱导表达。基因上下游嵌入酶切位点后,通过双酶切及T_4连接酶过夜连接的方法,构建出pPIC9K-His-OM-PLA1,将其导入毕赤酵母GS115中。结果显示,重组毕赤酵母为His+Muts表型即甲醇缓慢利用型,基因组DNA经凝胶电泳检测显示具有大小约为900bp的单一条带。在诱导72 h后,酶活到达最大为3.21 U/mL,目的蛋白经Ni~(2+)柱纯化和超滤管浓缩后,SDS显示特定的蛋白质条带,其分子量约为33 KDa,且酶活最大达到21.2 U/mL。分别在初始转接量为50 mL、温度为28℃和甲醇浓度为1%时,重组毕赤酵母分泌表达的OM-PLA1酶活较高。(4)外膜磷脂酶A1的固定化及酶法脱胶。采取水热共沉淀法制备了载体Fe_3O_4/氧化石墨烯,成功制备出载体材料后通过加入戊二醛将重组毕赤酵母分泌表达的外膜磷脂酶A1固定在载体材料上。最佳固定化条件是缓冲液pH为6、戊二醛的浓度为7%和固定化时间为3 h。制备出来的固定化外膜磷脂酶A1最适pH为7.5、最适温度为50℃,在4℃环境下保存近3个月后还留有58.9%的原始酶活力。将其用于粗菜籽油的酶法脱胶,pH 7.5、反应时间2.5 h、反应温度50℃是最佳脱胶条件,固定化外膜磷脂酶A1循环脱胶13次后,还具有初始酶活力的51.7%。
【图文】：

磷脂酶,甘油磷脂,位点

同而存在有差异，以此为依据可以将其主要分为两大酶。酰基水解酶中大致分为磷脂酶 A1、磷脂酶 A2 及甘油磷脂的 sn-1 位酰基、sn-2 位酰基及同时作用 sn-1用于-3 位酯键的是磷酸二酯酶，包括磷脂酶 C 和磷结构通式及各类磷脂酶水解时的作用位点如图 1.1 所脂酶主要以分泌型、膜结合型和胞内型等形式存在[2]有多种磷脂酶。其生物功能主要可以分为三大类：调；对细胞膜结构的维持和修复；体内磷脂的水解[3]。品中都含有磷脂且对其中的磷脂进行改性后能够适在食品工业应用中占有重要地位。在食品加工过程中节约能源、提高效率、改善性能或提高最终产品质量含的磷脂成分作用产生乳化剂样分子（例如溶血卵磷例如，，烘焙行业和蛋黄行业[4]中的磷脂酶应用。磷脂酶，植物粗油中的磷脂杂质在磷脂酶的作用下被除去，从

序列,磷脂酶A,二聚体结构,外膜

图 1.2 外膜磷脂酶 A 二聚体结构.2 The structure of outer membrane phospholipase Adim 的催化机制被归类于脂肪酶之中，但其序列和水溶性脂肪酶著的序列同源性且外膜磷脂酶 A 中不含有半胱氨脂酶 A 酶活性有重要意义的氨基酸残基就变得十知[23-24]，Ser-152 在稳定外膜磷脂酶 A 活性二聚体为其活性位点氨基酸，因 His 残基可以作为激 OM-PLA 酶活性中 His-142 的影响也是不可或缺的激活机制的体内激活模式如图 1.3 所示[22]。在正常生长的存在于细胞外膜中，此时处于自然休眠状态。而诱导发生破裂时，细胞外膜的完整性被破坏，此时
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS225.14;Q814

【参考文献】