重组解脂亚罗酵母合成微生物油脂的研究

发布时间：2020-05-21 23:25

【摘要】：随着化石资源的日益紧缺,微生物油脂作为新兴的可再生能源,受到研究者的极大关注。而其中产油酵母菌具有生长速度快,能积累较多生物量,油脂含量高等优点,应用前景广泛。但是对于产油酵母油脂代谢过程中不饱和脂肪酸合成的关键基因—脂肪酸脱氢酶对油脂合成的作用尚不明确。研究发现在解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)中过量表达SCD对细胞生长和油脂含量有显著作用。而Y.lipolytica脂肪酸代谢途径还有其他的脱氢酶,那么SCD到底是一个专一性的脱氢酶,还是一类脱氢酶都有相同的一个作用—提高油脂的含量,还需要继续进行探索。本研究通过结合油脂酵母三个方面的遗传改造,构建高产油脂酵母菌株YL-AD10;在此基础上探究脂肪酸脱氢酶(SCD,12D,15D)在油脂合成中的关键作用;考察构建的工程菌株(YL-12D15DA)在5L发酵罐内的生长及产油情况,为实现工业化培养奠定基础。本课题主要研究结果如下:(1)基于同源重组原理,分别敲除Y.lipolytica polf的pex10,mfe基因阻断油脂的降解途径,研究发现pex10-的菌株比mfe-菌株胞内油脂含量积累更多,相比原始菌株的油脂含量增加了1倍,而且对菌体的生长的抑制作用相对较小;在pex10-的菌株过量表达DGA1,油脂含量明显增加,比pex10-菌株的油脂含量增加47%,而且过量表达DGA1,脂肪酸组成基本保持不变;以pex10-,DGA1+为背景菌株,过量表达ACC1得到的菌株YL-AD10,油脂含量达到29.78%DCW,比对照菌株(DGA1+,pex10-)增加了 32%,脂肪酸组成成分变化不大。(2)在YL-AD10(pex10-,DGA1+,ACC1+)菌株中分别表达SCD,Δ12D和Δ15D(外源),结果表明这三个脱氢酶的过量表达都可以使菌体胞内油脂含量增加。过量表达Δ15D油脂含量增加最多,达到37.56%,而且亚油酸(LA)占总脂肪酸的含量从18.2%到23.6%,而油酸(OA)的含量有所下降。增加脂肪酸脱氢酶的拷贝数,油脂含量相应增加,其中过量表达12D-15D(YL-12D15DA)油脂含量最高,达到48.7%,比对照菌株YL-AD10提高了 63%。(3)在5L发酵罐对对照菌株polf和重组菌株YL-12D15DA进行发酵培养,在稳定期110 h后,细胞油脂含量达到最高,分别达到7.7%和33.7%DCW;荧光显微镜的图片显示出在对数期(72 h)部分polf的细胞呈现菌丝状,胞内有较小的清晰可见的油滴;菌株YL-12D15DA的细胞大部分呈现椭圆形,胞内油脂含量大约达到细胞体积的3/4。本研究通过结合油脂酵母三个方面的遗传改造,构建了高产油脂菌株YL-AD10(pex10-,DGA1+,ACC1+);在此基础上研究发现过量表达脂肪酸脱氢酶(12D,15D,SCD)可以显著提高油脂产量;而且同时表达12D-15D,得到的菌株YL-12D 15DA胞内油脂含量最高。这些为更好了解油脂代谢途径以及实现微生物油脂的工业化奠定基础。
【图文】：

三酰甘油,微生物细胞,合成机制,微生物油脂

１．３微生物油脂合成机制逡逑微生物合成油脂是由乙酰辅酶Ａ邋（ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ）的羧化反应开始，然后经过多逡逑次链的延长和去饱和作用形成各种脂肪酸，最后形成三酰甘油［５，５１］。图１－１是酵逡逑６逡逑

酵母,途径,基因,细胞干重

图２－１酵母中敲除基因及ｍａｒｋｅｒ去除途径逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ｋｎｏｃｋ邋ｏｕｔ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅ邋ａｎｄ邋ｍａｒｋｅｒ邋ｒｅｍｏｖｅ邋ｉｎ邋ｙｅａｓｔ逡逑２．３．８酵母细胞生长的测定逡逑（１）逦00＿值的测定：逡逑取发酵培养液１邋ｍＬ邋，选择合适的稀释度，用紫外分光光度计测定吸光值。逡逑（２）细胞干重的测定：逡逑取５０邋ｍＬ的发酵液，４０００ｘｇ，离心１0邋ｍｉｎ，弃上清，，收集菌体沉淀。去离逡逑子水清洗细胞２次，于１０５邋°Ｃ烘干至恒重，计算出每毫升发酵液的细胞干重，逡逑以ｍｇ／ｍＬ表示。然后利用细胞干重与ＯＤ值绘制标准曲线，细胞生长是通过测逡逑定发酵液的0Ｄ＿获得。逡逑２．３．９月旨肪酸成分分析逡逑２．３．９．１脂肪酸甲酯化逡逑
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TE667

【参考文献】