高效利用木糖产2,3-丁二醇Klebsiella pneumoniae的选育

发布时间：2020-05-23 00:43

【摘要】：2,3-丁二醇是一种重要的化工原料,广泛用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域。木糖是木质纤维原料水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖,因此,充分利用纤维素原料中的木糖、提高木糖2,3-丁二醇的转化率是高效利用纤维素原料生产2,3-丁二醇的关键问题之一。本研究通过对具有高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌株的差异基因进行RT-PCR验证和基因功能验证,对高效利用木糖的代谢机理进行了初步解析,并优化了该菌株的发酵条件,最后为提高2,3-丁二醇的产量对其进行基因工程改造,研究结果对于肺炎克雷伯氏菌高效利用木糖提供了理论意义和使用价值,对2,3-丁二醇的工业化生产奠定了坚实的基础,同时也为其它菌株代谢木糖的研究提供了有意义的参考。1)对差异基因中上调的基因过表达,下调基因敲除,并选取了 9个基因进行RT-PCR的验证。结果表明,跨膜转运相关的基因、参与戊糖磷酸途径的关键基因、糖酵解途的关键基因以及信号转导和电子传递相关基因表达量的提高,可以提高高木糖浓度条件下菌株耗糖能力和2,3-丁二醇的生产能力;减弱与2,3-丁二醇的生产竞争碳源和NADH的副产物途径,木糖消耗和2,3-丁二醇的得率也有一定的提高;RT-PCR验证RNA-seq差异基因表达量的结果显示,RT-PCR的表达量与RNA-seq的上下调趋势一致。2)在1L生物反应器水平对适应性进化筛选出的具有高木糖耐性的肺炎克雷伯氏菌株应用响应面法优化了其产2,3-丁二醇的发酵条件,得到最优发酵条件为:pH 5.9、温度35 ℃、转速230 r/min、通气量0.7 L/min,最优条件下2,3-丁二醇产量高达43.75 g/L,相比优化前提高32.7%。3)完全敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc,琥珀酸的产量和得率都有大幅度降低,菌株的生长速度变慢,但突变菌株2,3-丁二醇的得率比亲本菌株提高了 27%,理论转化率(50%)提高了 21%。敲除ppc启动子突变菌株的木糖利用和2,3-丁二醇的生成速度都有所降低,但2,3-丁二醇的得率略有提高。敲除催化富马酸生成琥珀酸的富马酸还原酶基因frdA 和frdBC,琥珀酸的含量略有降低,与原始菌株比较分别降低了 16.27%和25%,2,3-丁二醇的产量分别提高了 7.8%和10.2%,代谢副产物乙醇的含量分别提高了 13.14%和17.26%。
【图文】：

ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３，其中因为其分子结构手性碳原子有两个，因此该物质能以３逡逑种立体异构体的形式存在，分别为（Ｒ，Ｒ）－２，３－丁二醇（左旋型）、ｍｅｓｏ－２，３－丁二醇（内逡逑消旋型）和（Ｓ，Ｓ）－２，３－丁二醇（右旋型），其结构如图１－１所示［１］。逡逑０逦Ｈ逦０Ｈ逦０邋Ｈ逡逑１逦｝逦＾逡逑ＣＨ３逡逑＼邋ｃｈ３邋Ｈ３Ｃ逦：逦：逦ｃｈ３逡逑Ｉ逦￡逦￡逡逑ＯＨ逦ＯＨ逦ＯＨ逡逑Ｌ－＜＋）－２，３－ＢＤ逦ｍｅｓｏ－２，３－ＢＤ逦０－ｆ－＞２，３－ＢＤ逡逑Ｄｅｘｔｒｏｒｏｔａｔｏｒｙ邋ｆｏｒｍ逦Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ邋ｉｎａｃｔｉｖｅ邋ｆｏｒｍ逦Ｌｅｖｏｒｏｔａｔｏｒｙ邋ｆｏｒｍ逡逑（２Ｓ，３Ｓ）逦（２Ｒ，３Ｒ）逡逑图１－１邋２，３－丁二醇三种立体异构体逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｒｅｅ邋ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓ邋ｏｆ邋２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ逡逑三种旋光异构体的理化性质列于表１－１。逡逑表１－１邋２

在细菌代谢中，单糖首先必须先转化成丙酮酸，然后再生成主要产品。从葡萄糖逡逑通过糖酵解途径以相对简单的方式形成丙酮酸。相比之下，戊糖的丙酮酸生产必须通逡逑过磷酸戊糖途径和糖酵解途径的组合进行［５９］。如图１－２所示丙酮酸生成２，３－ＢＤ是混逡逑合酸发酵途径，，除了邋２，３－ＢＤ之外，生成的中间产物有ａ－乙酰乳酸、乙偶姻和双乙酰；逡逑主要副产物有琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇、甲酸等。及抑７／}＾冲；￥0菌株利用葡萄逡逑糖合成２，３－丁二醇过程中转化为其他副产物的代谢反应如下［２８］：逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ邋—？邋６Ｃ０２邋＋邋４ＡＴＰ＋１０ＮＡＤＨ２逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ＋邋３Ｈ２０邋２ａｃｅｔａｔｅ＋邋２Ｃ０２邋＋邋４ＡＴＰ＋邋２ＮＡＤＨ２邋＋邋２Ｈ２逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ邋—？邋ａｃｅｔｏｉｎ邋＋邋２Ｃ0２邋＋邋２ＡＴＰ＋邋２ＮＡＤＨ２逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ邋—？邋ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ邋＋邋２Ｃ0２邋＋邋２ＡＴＰ＋邋ＮＡＤＥｂ逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ＋邋２ＮＡＤＨ２￣？邋２ｅｔｈａｎｏｌ＋邋２Ｃ0２邋＋邋２ＡＴＰ＋邋２Ｈ２逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ邋—？邋２１ａｃｔａｔｅ＋邋２ＡＴＰ逡逑丙酮酸生成２，３－丁二醇的过程中涉及三种关键的酶，即ａ－乙酰乳酸合成酶逡逑（ａ－ＡＬＳ）、ａ－乙酰乳酸脱羧酶（ａ－ＡＬＤ）和２，３－丁二醇脱氢酶（ＢＤＨ，又名乙偶姻逡逑还原酶，ＡＲ）邋，邋ａ－乙酰乳酸合成酶进行两步反应：在初始阶段，丙酮酸与焦硫酸硫胺逡逑５逡逑
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ223.162;TQ920.1

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