基于右旋糖酐蔗糖酶催化受体反应定向合成低聚糖的研究

发布时间：2020-05-23 00:52

【摘要】：功能性低聚糖可作为益生元使用,具有调节人体肠道菌群结构、降低血脂、提高免疫力等生理功能,被广泛应用于功能食品、医药、饲料等领域。传统的直接提取法、酸水解法或酶水解法等制备方法存在产物质量差及产率低,操作步骤冗杂且成本较高等问题。而酶法合成低聚糖具有反应条件温和、体系简单及产率高等优点。右旋糖酐蔗糖酶可催化蔗糖水解成D-葡萄糖残基并不断转移至糖链形成右旋糖酐;但小分子糖类受体存在时可催化D-葡萄糖残基与受体连接合成低分子量的产物低聚糖。本课题针对低聚糖合成工艺存在的问题,通过小分子糖类受体干预反应体系,研究右旋糖酐蔗糖酶不同受体反应催化产物低聚糖的聚合机理,揭示外源受体对酶法合成右旋糖酐反应的影响规律;在此基础上引入右旋糖酐酶,研究双酶法对受体反应产物分子量及其分布的调控机制,以期为酶法催化受体反应定向合成低聚糖奠定坚实的理论依据与实验基础。主要研究内容及实验结果如下:(1)右旋糖酐蔗糖酶受体反应催化产物分析检测方法的构建。基于右旋糖酐蔗糖酶催化单底物蔗糖合成右旋糖酐过程中低分子量产物的发现,构建凝胶过滤色谱柱与氨基型亲水相互作用色谱柱两种检测方法。通过对比分析,发现凝胶过滤色谱柱双柱串联可有效分离右旋糖酐蔗糖酶受体反应中的多糖、低聚糖及单糖,跟踪监测产物分子量及其分布的变化情况;氨基型亲水相互作用色谱柱可分离鉴别并定量分析不同聚合度的低聚糖及某些糖类的同分异构体。同时,通过重复性、精密性及加标回收实验证明了这两种色谱柱检测方法的精密性、重现性及稳定性良好。(2)右旋糖酐蔗糖酶受体反应合成低聚糖的过程规律及其机制研究。利用三种小分子糖类受体(葡萄糖、麦芽糖及乳糖)分别干预酶法合成右旋糖酐的反应体系,探讨了右旋糖酐蔗糖酶不同受体反应催化产物低聚糖的聚合规律,研究了供受体比例、右旋糖酐蔗糖酶酶量及底物浓度对低聚糖和右旋糖酐的分子量及其分布、低聚糖产量及得率、蔗糖转化率与受体转化率的影响。实验结果证明,在不同受体分子作用下右旋糖酐蔗糖酶均会同时催化两种转糖基反应,即受体反应与多糖链延伸反应,聚合成两种分子量差异极大的产物(低聚糖与右旋糖酐)。受体分子的强弱决定了两种反应的竞争程度,但受体的存在对糖链延伸反应聚合形成副产物右旋糖酐的分子量(Mw106 Da)及其结构影响不大,表明受体作用不会改变右旋糖酐蔗糖酶催化右旋糖酐聚合的活性位点。受体比例越大,其与受体产物及右旋糖酐糖链竞争D-葡萄糖残基的能力越强,越容易合成低聚合度的产物,因此小分子量片段(3.6×102Da～103Da与103Da～104Da)所占比例不断上升,平均分子量逐渐降低。但不同受体产物的聚合度有所差异,葡萄糖与麦芽糖的受体产物可以作为新的受体物质不断连接D-葡萄糖残基而合成聚合度较高的低聚糖产物,其平均分子量均与受体比例、底物浓度及酶添加量成负相关关系;而乳糖受体反应在不同条件下仅合成一种聚合度为3的低聚糖,分子量均为504 Da,说明不同受体产物低聚糖的聚合度与受体分子的结构及性质密切相关,以葡萄糖基为糖单元的受体分子更容易被右旋糖酐蔗糖酶识别与利用而合成聚合度不同的系列低聚糖。此外,相对于葡萄糖与乳糖的受体产物,麦芽糖受体产物的小分子量片段(3.6×102Da～103Da与103Da～104Da)所占比例较大且麦芽糖转化率较高,说明麦芽糖分子与右旋糖酐蔗糖酶的亲和识别作用力较强,可吸附更多的右旋糖酐蔗糖酶促进糖基化聚合反应,使其受体产物低聚糖的得率较高;而葡萄糖与乳糖受体反应产物中大分子量片段(105 Da～106Da及106Da)所占比例较大,受体产物低聚糖得率与受体转化率均较低,体系合成了较多的副产物右旋糖酐,因此麦芽糖是右旋糖酐蔗糖酶的强受体物质,葡萄糖和乳糖是右旋糖酐蔗糖酶的弱受体物质。(3)利用右旋糖酐酶降解作用调控低聚糖合成过程的研究。小分子糖类受体的加入可以在一定程度上实现低聚糖的定向制备,但体系中会存在较多的副产物右旋糖酐。为了使副产物得到最大程度的利用,引入右旋糖酐酶对其分子量进行调控。结果发现右旋糖酐酶主要对大分子量右旋糖酐起降解作用而对麦芽糖受体反应的影响较小,反应趋向于合成聚合度较低的低聚糖。随着右旋糖酐酶酶量的增加,反应产物中大分子量片段(105 Da)被充分降解,小分子量片段(103 Da)所占比例不断增大,平均分子量不断降低的同时分子量分布逐渐变窄,说明右旋糖酐酶可有效调控产物分子量及其分布,产生结构更丰富多样的低聚糖;同时,供受体转化率几乎保持不变,低聚糖得率与右旋糖酐酶酶量成正相关关系。此外,在0.3 M蔗糖溶液、不同供受体比例的反应体系中,产物低聚糖平均分子量变化遵循经典Malhortra模型,拟合关系良好。
【图文】：

区域,右旋糖酐,蔗糖酶,三维结构图

图１－１右旋糖酐蔗糖酶的三维结构图［ｌ８］逡逑Ａ：蓝色区域；Ｂ：绿色区域；Ｃ：紫色区域；ＩＶ：黄色区域；Ｖ：红色区域逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｄｅｘｔｒａｎｓｕｃｒａｓｅ逡逑

右旋糖酐,蔗糖酶,催化反应,受体

由于右旋糖酐蔗糖酶具有蔗糖水解酶和糖苷转移酶两种催化活性，其催化作逡逑用过程分为：一催化蔗糖水解过程，获得增长链的能量及葡萄糖残基；二利用转逡逑糖基作用转移葡萄糖残基至糖链或小分子受体物质上的链增长过程［２６］。如图１－３逡逑所示，当右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖分子水解得到葡萄糖基－酶中间体后，根据受逡逑体的不同，催化糖基转移的反应分为两种ｔ２７，２８］：邋（１）以水作为受体的水解反应，逡逑使葡萄糖基－酶中间体形成游离的葡萄糖；（２）非水物质受体的转糖基反应，，又逡逑可分为：（ｉ）高分子量右旋糖酐的合成，以葡萄糖链为受体，主要延伸糖链的葡逡逑萄糖基结合部位；（ｉｉ）糖基化反应，以小分子糖类受体物质存在时，通过转糖基逡逑作用合成一系列新的功能性糖类化合物，也称为右旋糖酐蔗糖酶受体反应。受体逡逑分子非还原性末端的羟基会对酶－葡萄糖基中间产物的Ｃ１位进行亲核攻击，使葡逡逑萄糖基转移到它们的非还原性末端
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ281

【参考文献】