变形假单胞菌JUIM01 2-酮基-D-葡萄糖酸合成途径解析及其改造

发布时间：2020-05-25 13:05

【摘要】：2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid,2KGA)是合成杂环化合物和手性化合物的骨架材料,是生产FDA批准的食品级抗氧化剂D-异抗坏血酸的重要中间体;发酵法是目前最为经济、高效和环境友好的2KGA工业生产方法。本论文以一株糖酸转化率高达90%,但生产强度较低的2KGA工业生产菌株变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)JIUM01为研究对象,通过解析其2KGA合成途径,并鉴定其中的关键途径酶、辅酶和电子传递途径,在此基础上,对2KGA合成途径进行改造,以期进一步提高2KGA的生产强度。论文取得的主要研究结果如下:(1)解析了P.plecoglossicida JUIM01中2KGA合成途径。采用高通量Illumina测序技术对P.plecoglossicida JUIM01进行全基因组测序,结果显示其染色体大小5,074,901bp,G+C含量63.6%,ORF个数4592,ORF编码序列占总序列的87.31%,ORF平均长度965 bp,87.9%的ORF得到注释;细胞内不含质粒。P.plecoglossicida JUIM01在基因组上显示了区别于假单胞菌属模式菌株的独特性,属于从Pseudomonas putida种中独立出来的一个新种——P.plecoglossicida。通过比较基因组学分析,挖掘了葡萄糖代谢途径、2KGA合成途径、辅酶PQQ合成途径以及电子传递途径的相关基因,绘制了这些途径相关基因簇的基本结构,推断了2KGA合成途径。(2)鉴定了P.plecoglossicida JUIM01中2KGA合成途径的关键酶。对P.plecoglossicida JUIM01的膜结合葡萄糖脱氢酶(mGDH)进行分离纯化、酶学特性表征等研究,结果表明,野生mGDH为单亚基,分子量约为87 kDa;比酶活为16.85 U/mg;底物谱相对较宽(5种),最适底物为D-葡萄糖,K_m和V_(max)值分别为0.042 mM和14.620μM/min;最适pH 6.0,最适温度35°C,耐酸,热稳定性相对较差(55°C下2 h酶活完全丧失),Ca~(2+)/Mg~(2+)显著促进其酶活,EDTA/EGTA显著抑制其酶活。对mGDH的编码基因gcd进行敲除和回补,结果表明,敲除gcd阻断了2KGA合成,细胞生长速率降低19%;通过在大肠杆菌中异源表达mGDH,进一步验证mGDH在2KGA合成中的作用。采用同样的方法,鉴定了膜结合葡萄糖酸脱氢酶(mGADH),结果表明,野生mGADH比酶活90.71 U/mg;由分子量约为27 kDa的γ亚基、65 kDa的黄素蛋白亚基和47 kDa的细胞色素c亚基共3个亚基组成,黄素蛋白和细胞色素c亚基分别含有1个假定的FAD结合基序和3个可能的血红素结合基序(C-X-X-C-H);该酶对D-葡萄糖酸具有严格的底物特异性,K_m和V_(max)值分别为0.631 mM和0.734 mM/min;最适pH 6.0,最适温度35°C,有较好的耐酸性和热稳定性,Ca~(2+)和Mn~(2+)可促进其酶活提高;进一步通过异源表达mGADH,证实其在2KGA合成中的作用。(3)解析了P.plecoglossicida JUIM01的电子传递途径和辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)合成途径。通过电子传递链的生化抑制方法,明确电子传递链的末端氧化酶种类为Cyo氧化酶、CIO氧化酶以及3种细胞色素c氧化酶,初步确定P.plecoglossicida JUIM01催化氧化葡萄糖时的电子传递链系统的组成为:PQQ-mGDH、泛醌以及5种末端氧化酶,其中2个对苯二酚氧化酶(CIO氧化酶和Cyo氧化酶)发挥主要作用。进一步对相关基因簇中的各基因分别进行转录水平分析和生物信息学分析,确定了pqq操纵子的基因组成包括pqqF、pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqM、pqqH,以及位于反向互补链上的pqqI;非编码序列中存在6个启动子区、7个终止子区和6个核糖体结合位点;pqqF独立转录,pqqF具有一个独立的启动子和终止子,pqqC、pqqD、pqqE、pqqM这4个基因同属于一个转录单元,pqqM和pqqH则不属于同一个转录单元;pqqF、pqqA和pqqB与gcd的表达量正相关,其中pqqF与P.plecoglossicida JUIM01发酵产2KGA的相关性最大,可作为改造P.plecoglossicida JUIM01提高2KGA生产强度的潜在靶点。(4)改造P.plecoglossicida JUIM01生产2KGA。构建增强表达2KGA合成途径的两个关键酶mGDH和mGADH的工程菌,当采用20 g/L葡萄糖为底物,在500 mL摇瓶中,重组菌P.plecoglossicida JUIM01/pBBR1MCS-2-gcd-gad的gcd基因表达量提高3.21倍,总酶活提高36%;gad(编码mGADH)基因表达量和总酶活均提高5.66倍,葡萄糖消耗速率和2KGA生产强度均提高25%;当采用140 g/L葡萄糖为底物,在30 L发酵罐规模上,葡萄糖消耗速率提高23.1%,2KGA生产强度提高34%。通过辅酶改造解决PQQ供应不足问题,进一步提高了2KGA生产强度,在140 g/L葡萄糖起始浓度的30 L发酵罐中,重组菌P.plecoglossicida JUIM01/pBBR1MCS-2-gcd-gad-pqqF的葡萄糖消耗速率和2KGA生产强度比改造前的菌株分别提高21.28%和21.41%;比出发菌P.plecoglossicida JUIM01分别提高61.23%和62.61%。
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第一章 绪论第一章 绪论酸的理化性质与用途（2-keto-D-gluconic acid，简称 2KGA），Ketogluconicacid、2-Dehydro-D-gluconate、acid、α-D-arabino-2-Hexulosonic acid；其它戊二酸、D-阿拉伯-2-己糖醛酸；分子式：C子质量：194.1394；CAS 登录号：669-90征：白色粉末状晶体，无臭；具有较强吸醇，不溶于绝大多数有机溶剂。

图 1-2 推测的假单胞菌葡萄糖代谢途径Fig. 1-2 The presumed pathway of glucose metabolism in Pseudomonas注：OM：细胞外膜；PS：周质空间；IM：细胞内膜。值得一提的是，2015 年 Umezawa 等[5]对目前公认的以上假单胞菌 2KGA 合成途径提出了挑战，他们首次在 Pseudomonasaureofaciens 中发现了可催化 2-酮基-D-葡萄糖为2KGA 的 2-酮基-D-葡萄糖脱氢酶（2-keto-D-glucose dehydrogenase）编码基因，提\，

本文编号：2680195