κ-卡拉胶寡糖酶法制备及其免疫防御调节机制的研究

发布时间：2020-05-25 18:15

【摘要】：卡拉胶(Carrageenans或Carrageenins)是从可食用红藻(角叉菜、杉藻等)中提取的一类线性硫酸海藻多糖,具有较好的凝胶性、增稠稳定性等,被广泛应用于食品工业中,同时卡拉胶多糖具有较好的抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等功能活性。然而,高分子卡拉胶多糖粘度大,在生物机体内难以被吸收,限制了其功能活性的应用,而降解后得到的半乳寡糖硫酸酯容易吸收、毒性低,活性基团大量暴露。因此,高效制备卡拉胶寡糖是推进红藻寡糖精深加工及应用的重要途径。本论文以κ-卡拉胶为目的碳源,从角叉菜海藻中筛选可有效酶解κ-卡拉胶的新型细菌,对其进行分子水平鉴定,并建立该菌株的发酵动力学模型;采用固定化微生物技术,以磁性Fe304-Chitosan为载体,制备菌体高浓度富集的固定菌微球,用于高效连续制备K-卡拉胶酶及κ-卡拉胶寡糖,并分析固定化结合机理;采用切向超滤膜技术对K-卡拉胶寡糖进行初步分级,进一步使用中低压制备色谱联合蒸发光散射检测器快速分离纯化得到K-卡拉胶寡糖单体,采用ESI-MS、CID-MS/MS及NMR等检测技术分析各寡糖结构序列;以LPS构造巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型为研究对象,评价对比K-卡拉胶寡糖各单体的免疫防御功效。基于系统生物学分析方法,建立K-卡拉胶寡糖干预巨噬细胞免疫调节的蛋白互作网络图,从蛋白质组学水平阐明其作用机理。首先,从角叉菜海藻中分离获得一株可有效降解κ-卡拉胶的菌株,经16S rDNA鉴定为海旋菌属,并命名为Thalassospira sp.Fjfst-332(TF-332)。通过 Box-Behnken 响应面优化,菌株 TF-332发酵产κ-卡拉胶酶的最佳发酵参数为:温度25℃、pH 7.0、接种量3 mL、装液量30mL、转速125r/min;发酵培养基配方:2g/Lκ-卡拉胶、1g/L 酵母膏、20g/LNaCl、1g/LFOS、2g/LNaNO3、0.5g/L MgSO4·7H2O、1g/LK2HPO4和 0.1 g/LCaC12,在此最优工艺参数下,检测得到最高酶活为267 U/mL。分别建立菌株TF-332在不同发酵条件下的经验生长动力学模型和产酶动力学模型方程,该模型的建立可为菌株工业化发酵过程的调控提供理论依据。采用固定化微生物技术,以磁性Fe3O4-Chitosan为载体,制备菌体高浓度富集的固定菌微球,通过多种物理方法(XRD、VSM、FTIR、SEM、CLSM、Raman spectra)对固定菌进行表征并发现菌株TF-332与载体Fe3O4-Chitosan通过壳聚糖表面的amide Ⅱ(-NH2)基团有效结合。载体Fe3O4-Chitosan吸附菌体的最佳参数为:20℃条件下吸附作用3 h;固定菌发酵产酶的最佳参数为:培养基初始pH 7.0、发酵温度30℃、固定菌添加量700mg/30mL。另一方面,与游离菌TF-332发酵相比,固定菌IMB发酵生产κ-卡拉胶酶的效率提高了 41.7%,κ-卡拉胶酶产量提高了 66.7%,并且在7个重复使用周期后,菌株发酵产酶的能力为初始菌株的66.18%。结果表明固定菌有效提高了游离菌发酵产酶效率和产酶量,且发酵稳定性相对游离菌显著增强,可用于K-卡拉胶酶及κ-卡拉胶寡糖连续性批量生产。为了深入研究κ-卡拉胶寡糖的结构与功能的关系,研究采用中低压制备色谱-蒸发光散射系统分离纯化制备K-卡拉胶寡糖单体,最佳分离纯化工艺参数为:流速4mL/min,上样浓度1.0g/mL,进样体积为1mL,流动相为0.1MNH4HCO3,在此参数下,分离纯化得到四种K-卡拉胶寡糖单体,纯品总得率为5.02%。经ESI-MS及CIE-MS/MS检测,这四种寡糖分别为分子量404 Da、807 Da、1210 Da、1273 Da的κ-卡拉胶二糖、四糖、六糖及杂合型κ/ι-卡拉胶六糖。核磁共振分析结果表明,该酶解寡糖系列以G4S为还原端,结构简式分别为:α-DA-1→3-G4Srα/β(κ-卡拉胶二糖);α-DA-1→3-β-G4S-1→→4-α-DA-1→3-G4Srα/β(κ-卡拉胶四糖);α-DA-1→3-β-G4S-1→4-α-DA-1 →3-β-G4S-1→4-α-DA-1 →3-G4Srα/β(K-卡拉胶六糖);α-DA/DA2S-1→3-β-G4S-1-4-α-DA-1→3-β-G4S-1→4-α-DA-1→3-G 4Srα/β(κ/ι-卡拉胶六糖)。采用LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7为炎症细胞模型,研究纯κ-卡拉胶寡糖的免疫防御功效。试验结果表明,四种纯κ-卡拉胶寡糖在剂量浓度75 μg/mL内无细胞毒性,当剂量浓度大于300μg/mL时,巨噬细胞存活率显著下降。此外,四种K-卡拉胶寡糖从生理水平及转录水平上分别剂量依赖性地抑制了炎症介质(ROS、NO、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10)的分泌,同时对iNOS及COX-2蛋白的表达也起到了抑制效果,降低了细胞炎症反应,表明κ-卡拉胶寡糖具有免疫防御功效,四种κ-卡拉胶寡糖的免疫防御能力表现为KCO-4KCO-3KCO-2KCO-1,即聚合度越高的κ-卡拉胶寡糖免疫调节效果越好,同一聚合度下硫酸基团含量越多的κ-卡拉胶寡糖免疫防御功效较好。采用蛋白质组学分析技术,从蛋白质组水平上分析四种κ-卡拉胶寡糖的免疫防御机制。首先,通过高通量检测,共鉴定了 4547个蛋白质,以LPS实验组为对照组,KCO-1、KCO-2、KCO-3、KCO-4组分别筛选出236、370、450、135个差异蛋白质具有统计学意义。从整体蛋白功能层面分析,KCO-1组的差异蛋白功能表征相对其他三组具有较大差异性,差异蛋白在细胞周期、细胞凋亡与增殖、DNA复制等功能模块具有较大的富集。KCO-2、KCO-3及KCO-4组的差异蛋白在蛋白功能表征方向具有相似性,差异蛋白主要参与RNA转录后修饰、RNA转运、机体损伤等相关信号通路。从LPS诱导的炎症相关通路层面分析,四种κ-卡拉胶寡糖预处理巨噬细胞后,当LPS入侵巨噬细胞,经典炎症通路上的三个关键蛋白质CD14、Rel、p50均表现出了显著下调现象,说明由CD14触发,Rel、p50介导的NF-κB信号通路(CD14/Rel@p50)受到抑制,即κ-卡拉胶寡糖通过抑制NF-κB信号通路上的蛋白CD14、Rel、p50表达,从而起到免疫防御效果,抑制相关炎症因子NO、ROS、TNF-α、IL-1β、IL-8等的过量分泌。该研究成果为进一步开发κ-卡拉胶寡糖功能食品奠定重要的理论基础。
【图文】：

序列,菌株,平板培养,卡拉胶

研究采用Ｋ－卡拉胶作为唯一的碳源诱导筛选可降解Ｋ－卡拉胶多糖的微生物。逡逑其中，菌株ＴＦ－３３２在平板培养基上发酵培养后表现出最佳降解能力，即形成明逡逑显的凹形液化圈（图２－１Ａ）。根据Ｂｅｒｇｅｙ手册检测分析该菌株的生理生化特征逡逑（表２－２）并采用ＴＥＭ电镜扫描分析菌株基本形态如图所示（图２－１Ｂ）。逡逑ＰＣＲ测序分析，细菌１６ＳｒＤＮＡ序列经比对与海旋菌（Ｕｔｍａｖｐ／Ｖａｓｐ．）逡逑＋柯邋９８．７％的同源性（ＧｅｎＢａｎｋ邋Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ邋Ｎｕｍｂｅｒ邋ＥＵ４４０７９０），序列大小为邋１４８７邋ｂｐ。逡逑采用Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｉｏｎｉｎｇ邋（ＭＥＧＡ６．邋０６）构建系统进化树如图２－２所示，可看出与该逡逑菌株最为接近的细菌种属为海旋菌屈７７ｉｒｔ／ｆｌｉ＼ｙ0ｓ７；／＞＜７ｓｐ．，这与ＢＬＡＳＴ比对结－逡逑？致，结合形态学特征，将该细菌鉴定为海旋晸，并将其命名为ＴＶｗ／ａＭｔｔｖｐ／ｒｃ／ｓｐ．逡逑Ｆｊｆｓｔ－３３２邋（ＴＦ－３３２）。海旋菌是一种海洋细菌，其降解功能主要逡逑集屮在水解烷烃和多环芳烃对卡拉胶的酶解功能目前还未见具体报道

柏拉图,柏拉图,生长量,酶活

逑２．３．５爬坡设计Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ邋（ＰＢ）筛选显著变量逡逑２水平１１因素的ＰＢ设计如表２－３所示，结果如表２－４所示。图２－５阐述了逡逑Ｐａｒｅｔｏ邋Ｃｈａｒｔ邋（／？＜邋０．０５）的显著性结果。Ｋ－卡拉胶、ＮａＣｌ、酵母膏及低聚果糖的逡逑ｔ值均大于ｔ－ｖａｌｕｅｌｉｍｉｔｅ邋（ｔ＞２．３６４６２），说明了预测值是显著、可接受的。根据逡逑ＰＢ设计及Ｐａｒｅｔｏ邋Ｃｈａｒｔ的回归结果可知响应不存在任何显著虚拟值，意味着ＰＢ逡逑设计不存在系统误差和未知误差。对于酶活来说，ｋ－卡拉胶、ＮａＣｌ、酵母膏及低逡逑聚果糖Ｆ０Ｓ为显著因子（图２－５Ａ）。对于菌株生长量来说，ＮａＣｌ表现出显著的逡逑抑制效果（图２－５Ｂ），即表明菌株ＴＦ－３３２对高盐环境较为敏感且低浓度的ＮａＣｌ逡逑有利于菌株生长。除此之外，Ｋ－卡拉胶、酵母膏及低聚果糖ＦＯＳ对菌株生长量逡逑具有正向显著效果。总之，，Ｋ－卡拉胶、：ＮａＣｌ、酵母膏及低聚果糖ＦＯＳ为影响Ｋ－逡逑卡拉胶酶酶活及菌株ＴＦ－３３２生长量的显著变量
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ929

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