解脂耶氏酵母中甲羟戊酸途径的过氧化物酶体定位增强α-法呢烯合成

发布时间：2020-06-04 09:31

【摘要】：解脂耶氏酵母(Yarrowialipolyticaa)是一种非常规的产油酵母,由于其充足的前体供应,适于生产各种源于乙酰辅酶A的下游化合物。但以葡萄糖为碳源时,产生乙酰辅酶A的同时会伴随二氧化碳(CO2)的释放,造成碳损失及得率的降低。而以脂肪酸作为底物时,脂肪酸转化成酰基辅酶A后进入过氧化物酶体,经过β-氧化产生乙酰辅酶A,这一过程不产生C02,不存在碳源的损失,具有更高的碳转化率。近年来越来越多的研究表明,特定酶或者代谢途径的亚细胞定位不仅有助于提高产物转化效率,而且能够起到消除竞争性代谢抑制的作用。因此,本论文将甲羟戊酸途径过表达并定位至解脂耶氏酵母过氧化物酶体,构建α-法呢烯合成工程菌,以脂肪酸或油脂为碳源,高效合成乙酰辅酶A下游产物,重要萜类化合物α-法呢烯。首先,本研究测试了文献报道的在酿酒酵母使用的增强型过氧化物酶体定位信号(ePTS1),可以高效地在解脂耶氏酵母中将目的蛋白定位至过氧化物酶体。在此基础上,使用该定位信号(ePTS1)将甲羟戊酸合成途径的三个基因AtoB、HMGS、HMGR定位至过氧化物酶体,得到能够利用脂肪酸高效生产甲羟戊酸的工程菌株MP2。通过摇瓶发酵分析,解脂耶氏酵母工程菌株MP2可以产生约2.725 g/L甲羟戊酸,得率达到0.072 g/g底物,而胞质超表达甲羟戊酸途径的对照工程菌株M1的甲羟戊酸产量虽然相当,但得率仅为0.031 g/g底物。该研究结果表明,甲羟戊酸合成途径基因的过氧化物酶体定位,能够使解脂耶氏酵母利用脂肪酸生产甲羟戊酸,其得率比在胞质中利用葡萄糖生产甲羟戊酸的得率更高。解脂耶氏酵母胞质中自身存在MVA途径,适合萜类化合物的合成。倍半萜α-法呢烯是一种有潜力的生物燃料,具有重要的应用价值。在高产甲羟戊酸菌株MP2的基础上,超表达α-法呢烯合成酶FS,使解脂耶氏酵母可以利用油酸合成72 mg/L α-法呢烯。在胞质中逐步过表达从甲羟戊酸到α-法呢烯合成途径的关键酶,α-法呢烯的产量逐步增高。在胞质过表达α-法呢烯合成途径全部酶的工程菌株F4,利用油酸发酵120 h,α-法呢烯的产量达到0.365 g/L。与此同时,逐步将从甲羟戊酸至α-法呢烯合成途径的酶过表达并定位至过氧化物酶体,α-法呢烯产量逐步增高。全部酶在过氧化物酶体定位表达的工程菌株FP3利用YPO培养基发酵120 h,α-法呢烯产量达到0.391 g/L,比工程菌株F4生产α-法呢烯的产量略高,说明α-法呢烯代谢途径定位至过氧化物酶体可以避免胞质环境的代谢竞争,有利于α-法呢烯的专一性合成,提高了 α-法呢烯的产量,但是由于甲羟戊酸可以自由通过过氧化物酶体膜,较多的法呢烯代谢途径基因可能对蛋白质的定位效率造成负面影响,导致工程菌株FP3的α-法呢烯产量与F4相差不多。本研究还探究了解脂耶氏酵母FP3利用不同种类油脂生产α-法呢烯的情况。结果表明,工程菌株FP3可以高效利用不同种类油脂生产α-法呢烯,与利用油酸作为碳源相比,三油酸甘油酯更有利于工程菌株FP3生产α-法呢烯。在发酵罐中进行补料分批发酵,工程菌株FP3利用三油酸甘油酯并控制pH为6.0进行发酵168 h,α-法呢烯产量达到1.66 g/L,得率达到0.025 g/g底物。
【图文】：

法呢烯,结构式

图１－１邋ａ－法呢烯结构式逡逑隆并分离鉴定了一种来源于Ａｎｇｌｏｎｇ邋Ｗａｎｇ等对大肠杆菌进量达到３８０邋ｍｇ／Ｌ［８６］，而另一。ＳｔｅｆａｎＴｉｐｐｍａｎｎ等利用酿耶氏酵母适合ａ－法呢烯的生量和得率都比较低，仅为２６０往往利用葡萄糖进行包括ａ－为碳源时，丙酮酸脱羧形成萜类化合物合成的得率降低，与意义逡逑

荧光标记,解脂耶氏酵母,同源重组,整合型质粒

２．３．２甲羟戊酸合成途径基因的克隆表达逡逑解脂耶氏酵母表达载体分为两种，即游离型质粒和整合型质粒。游离型表达逡逑载体可以在解脂耶氏酵母细胞里进行复制而游离存在，常见的游离型质粒有逡逑ＹＬＥＰ，根据其筛选标记分为ＹＬＥＰ－Ｌｅｕ和ＹＬＥＰ－Ｕｒａ，需要在相应的营养缺陷型逡逑培养基中ＳＤ－Ｌｅｕ和ＳＤ－Ｕｒａ中培养才能使其稳定存在。而酵母整合型质粒需要逡逑整合到酵母染色体上，才能随着染色体的复制而稳定存在。常见的解脂耶氏酵母逡逑整合型质粒有ｐＩＮＡ１３１２、ＪＭＰ１１３和ＪＭＰ１１４，以及由它们衍生而来的一系列质逡逑粒。酵母基因整合方法主要分为同源重组（ＨＲ）和不依赖同源臂的基因组整合逡逑方式［２２］。酿酒酵母中同源重组的效率较高，，然而，与酿酒酵母不同，解脂耶氏逡逑酵母中同源重组的效率很低，ＤＮＡ双链断裂（ＤＳＢ）修复的主要方式是通过非逡逑同源末端连接（ＮＨＥＪ）的方式进行。先前工作中，本课题组在解脂耶氏酵母中逡逑建立了一种不依赖同源臂的基因组整合方法，该方法具有易操作、高保真性、易逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6;O629.61

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