油酸水合酶与脱氢酶级联催化制备10-羰基硬脂酸

发布时间：2020-06-05 01:25

【摘要】：本课题从丰富和可再生的油酸原料出发,使用油酸水合酶生物催化合成生物可降解性化学品10-羟基硬脂酸;同时将上述油酸水合酶与10-羟基硬脂酸脱氢酶级联,催化油酸转化直接合成更加有用的10-羰基硬脂酸。上述酶促级联反应,不仅条件温和、时空产率高,而且反应产物10-羰基硬脂酸经过进一步裂解和转化后,可以合成多种高附加值的中链二元酸、羟基酸和ω-氨基酸等功能化学品。本课题的研究内容主要分为以下三个部分:(1)油酸水合酶的筛选。以已报道的油酸水合酶的蛋白序列为探针,在生物数据库中挖掘、筛选潜在的油酸水合酶。从实验室保藏的菌种库和基因组数据库中挑选不同类型的菌株和基因组进行克隆,在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达,并测定其对油酸的水合能力。其中来源于Paracoccus aminophilus的油酸水合酶(简称PaOH)表现出较高的活力。(2)PaOH的表征与酶促水合反应的优化。PaOH在pH 6.5、30℃和4%(v/v)DMSO(助溶剂)的存在下展现出最高活力。在最适条件下,测得PaOH的比活力为5.21U·mg-1。PaOH的催化效率常数(kcat/KM)为10,700min-1·mM-1,是目前已知油酸水合酶中最高的。25℃与30℃下PaOH的半衰期分别为4.05 h和3.02 h。对PaOH催化的油酸水合反应的底物和催化剂上载量进行了优化,当底物上载量为90 g·L-1,酶粉加入量为10 g·L-1,反应进行4 h后,转化率达96.1%,时空产率为552 g·L-1·d-1。产品最终的分离得率为67.9%(mol/mol),纯度达99.3%。(3)水合酶与脱氢酶的级联催化反应。因为10-羟基硬脂酸脱氢酶(MlDH)的酶促反应需要昂贵的辅酶NAD+作为辅底物,所以需要构建一个辅酶循环再生的体系。经过分析比较,本文选用乳酸脱氢酶(LDH)与MlDH进行偶联,以实现辅酶的循环再生。为了使水合酶PaOH的催化能力达到最大,我们采用一锅两步的反应方式进行级联催化。在底物上载量为90 g·L-1,PaOH酶粉加入量为10 g·L-1,NAD+添加量为0.1 mM,LDH与MlDH酶粉的加入量分别为0.5 g·L-1的条件下,反应10 h后油酸转化率达95.0%。最终产品10-羰基硬脂酸的分离得率为51.9%(mol/mol),纯度达99.0%。
【图文】：

报道了一个含有黄素腺嘌呤二核苷酸（ＦＡＤ）的油酸水合酶晶体结构，该油酸水合酶来自逡逑为了得到蛋白与辅因子的复合物，在纯化过程的最后一逡逑步加入ＦＡＤ温育，得到的晶体结构如图１．４，分辨率为２．７５埃，该结构是由两个蛋白分逡逑子结晶得到的不对称同型二聚体。在Ａ链中，ＦＡＤ非共价结合在Ｒｏｓｓｍａｎ型结构域和逡逑底物结合结构域的界面｜３３］。逡逑基于结构和功能分析，Ｅｎｇｌｅｄｅｒ等提出了黄素依赖型水合酶的反应机理，其中氨基逡逑酸Ｅ１２２和Ｙ２４１在Ｃ邋＝邋Ｃ双键的水合作用中起酸碱催化剂的作用，且ＦＡＤ在活性位点逡逑的正确组织中扮演着重要角色。逡逑图１．４来源于的油酸水合酶（同型二聚体）结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ］邋．４０ｖｅｒａｌｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｏｌｅａｔｅ邋ｈｙｄｒａｔａｓｅ邋（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）邋ｆｒｏｍ邋Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ邋ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ．邋Ｒｉｂｂｏｎ逡逑ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｎ邋ＯｈｙＡ邋ｄｉｍｅｒ邋ａｓ邋ｐｒｅｓｅｎｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．邋Ｃｈａｉｎ邋Ａ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｇｒｅｙ邋ａｎｄ邋ｃｈａｉｎ邋Ｂ邋ｉｎ逡逑ｍａｇｅｎｔａ．邋ＦＡＤ邋（ｙｅｌｌｏｗ）邋ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ邋ｐｒｅｓｅｎｔ邋ｉｎ邋ｃｈａｉｎ邋Ａ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｓｔｉｃｋ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．逡逑１．２．３油酸水合酶的分类逡逑２０１７邋年，韩国邋Ｗｏｏ－Ｒｉ邋Ｋａｎｇ邋等人在嗜麦芽窄食单胞菌逡逑中发现一个新的油酸水合酶，新发现的油酸水合酶与之前在该菌株中发现的水合酶之间逡逑存在一定的差异。作者根据两个酶ＦＡＤ结合基序的差异

接下来Ｗｏｏ－Ｒ！邋Ｋａｎｇ等尝试从蛋白氨基酸序列的角度去解释这个现象。众所周知，逡逑谷胱甘肽还原酶家族的所有成员，包括ＯｈｙＡ，，都含有一个相同的基序，即五个保守残逡逑基的ＦＡＤ结合基序ＧＸＧＸＸＳ（ａ／ｇ）Ｘｉ５Ｅ（ｄ）Ｘ５Ｅ（Ｘ表示任何氨基酸）。如图１．５中，将己表逡逑征过的油酸水合酶进行序列比对，发现ＯｈｙＡｌ型油酸水合酶的第四个保守残基是Ｅ（Ｄ），逡逑而这个残基在０ｈｙＡ２型油酸水合酶中不是保守的。将来自＊Ｓ．逦的两类油酸水逡逑合酶序列上的第四个氨基酸进行突变：Ｓｍ－ＯｈｙＡｌ突变为ＥＳＯＡＡｍ－ＯｈｙＡＺ突变为Ｑ８０Ｅ。逡逑通过添加ＦＡＤ，野生型ＯｈｙＡｌ的活性显著增加，突变体ＯｈｙＡｌＥ５ＱＡ的活性没有影响；逡逑而野生型ＯｈｙＡ２和突变体ＯｈｙＡ２（ｊ８0Ｅ表现出相反的特性。因此，第四个保守氨基酸可逡逑能是区分ＯｈｙＡ类型的关键。逡逑ＦＡＤ－ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｍｏｔｉｆ逡逑２０逦ＶＤＥＫＳＡＭＪＨＰｆ＾ＡＡＣＦＬＩＲＤＧＣＭＫＧｆｌｌＨＩＬｐＤＩＳＱＳＳＬＤＧＩＵＰＴＲＧＦＩ邋ＩＲ３／．触
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ426;TQ225.4

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本文编号：2697278