Sulfolobus acidocaldarius麦芽寡糖基海藻糖水解酶的分子改造

发布时间：2020-06-08 00:53

【摘要】：麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141)能特异性识别底物麦芽寡糖基海藻糖的海藻糖部分,并通过水解作用生成海藻糖。产物海藻糖由于具有保湿、防晒和低甜度等特点,被应用于生物医药、食品和日化等行业。来源于嗜酸热硫矿硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTHase具有制备海藻糖的优良性能,但在其重组制备过程中容易形成较多包涵体,影响可溶性表达,导致使用成本高。本研究对S.acidocaldarius MTHase进行改造:基于多重序列比对,选取21个疏水氨基酸进行替换以提高MTHase的可溶性表达。以获得的突变体L202P/L218D/Y323G的质粒为模板,通过随机突变,筛选获得有效突变体。对有效突变体进行饱和突变和叠加突变,得到最佳突变体。在最佳突变体摇瓶发酵的基础上进行3 L罐发酵优化。主要研究结论如下:(1)对S.acidocaldarius MTHase进行多重序列比对,选择非保守区域的位于蛋白表面的21个疏水氨基酸,替换为相同位点上的其他来源的亲水氨基酸(除了202位点:其他来源的此位点是疏水氨基酸),研究蛋白可溶性表达。突变体Y21Q、L77E、L202P、L218D和Y323G酶活分别提高1.2、1.4、1.3、1.3和1.4倍,通过叠加突变,其中突变体L202P/L218D/Y323G酶活最高,达到59.4 U·mL~(-1),该突变体酶活提高1.9倍。(2)对突变体L202P/L218D/Y323G进行酶学性质研究。结果显示,与野生型酶比较,氨基酸的替换对MTHase酶学性质的影响甚微。该突变体酶活提高是因为蛋白表达量的提高。(3)以突变体L202P/L218D/Y323G的质粒为模板,通过随机突变构建突变文库并结合高通量快速筛选,最终获得两株酶活提高的突变体。突变体抽提质粒,进行测序确认突变位点,对有效突变体进行饱和突变和叠加突变,最终获得的最佳突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T(简称突变体MTHase~m)酶活比野生型高2.4倍。(4)对最佳突变体进行酶学性质研究,结果显示突变体的酶学性质与野生型相似。将突变体与实验室保存的相同来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)共同作用麦芽糊精(DE值5-7)生产海藻糖,结果显示海藻糖转化率未受到较大影响。(5)对突变体MTHase~m进行3 L罐发酵优化,最佳发酵条件为:发酵前期37℃恒温培养,当OD_(600)达到50时,温度降低至30℃,恒速流加乳糖(流速为0.1 g·L~(-1)·h~(-1))进行诱导。诱导27 h,该突变体的酶活最高达到444.8 U·mL~(-1),约为摇瓶发酵酶活的5.9倍。
【图文】：

图 1-1 麦芽寡糖基海藻糖水解酶的空间结构 1-1 Spatial structure of maltooligosyl trehalose trehalohydr表 1.1 来源不同的 MTHase 酶学性质Table 1.1 Different properities of MTHase from different bacteriu

化机制及底物专一性水解活性，主要以麦芽寡糖基海藻糖作为底物THase 为例，麦芽寡糖基海藻糖从 N 端结构域的表 之间的缺口移动，随后到达(β/α)8桶的 C 末端。308378 位的谷氨酰胺与底物还原端形成的氢键和 Trp215对底物海藻糖部分高效识别，并切割邻近α-1, 1-糖苷(如图 1-2 所示)。该催化反应认为是通过一般酸/碱催似[27]。序列和结构比较表明，，Sulfolobus solfataricus , 4-糖苷键中-1 亚位点的 C1，E283 作为质子供体，底物，对-1 亚位点的葡萄糖作用形成较多的氢键[17]芽寡糖基海藻糖作用于α-1, 1-糖苷键，也催化麦芽释放葡萄糖，其活性约为水解麦芽寡糖基海藻糖释放
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.1

【参考文献】

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本文编号：2702264