重组华根霉脂肪酶非水相酯合成活性的激活研究

发布时间：2020-06-12 11:18

【摘要】：脂肪酶在非水相中催化的酯化反应具有重要的工业应用。天然脂肪酶的非水相酯合成活性普遍较低,研究如何提高脂肪酶的非水相催化活性具有重要的理论和实际应用价值。来源于丝状真菌华根霉的脂肪酶具有较高的酯合成活性,但是异源表达的华根霉脂肪酶未表现出酯合成活性。本研究以异源表达的华根霉前导肽脂肪酶(r27RCL)和成熟肽脂肪酶(mRCL)为研究对象,分别通过不同方法对酶蛋白进行处理,提高重组脂肪酶的酯合成活性,为工业应用奠定基础。主要研究内容和结果包括:(1)针对异源表达的商品化华根霉前导肽脂肪酶r27RCL,研究表面活性剂等处理条件对脂肪酶酯合成活性的激活效果,提高r27RCL的催化活性。结果表明,不同表面活性剂对脂肪酶的作用效果明显不同,其中n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)可有效提高r27RCL酯合成活性。DDM对r27RCL的激活效果取决于二者的摩尔比,而非单纯的表面活性剂浓度。当DDM与r27RCL的摩尔比值大于30后,随着DDM添加量增加,r27RCL的酯合成活性不断提高。pH和无机盐会对DDM对r27RCL的激活效果有一定的影响。其中,改变磷酸盐浓度可以强化DDM对r27RCL酯合成活性的激活效果,最适条件下比活力进一步提高96%。(2)针对由E.coli表达的华根霉成熟肽脂肪酶mRCL包涵体蛋白,研究变性、复性以及添加表面活性剂对脂肪酶酯合成活性的影响。由于mRCL在E.coli中表达主要形成包涵体,在表达条件优化,提高mRCL包涵体表达水平的基础上,进行蛋白变性、复性处理。在初始蛋白浓度100μg·mL~(-1),复性温度4℃,pH 8.0条件下,结合梯度降低尿素浓度进行透析复性,可溶性蛋白回收率可达72%,但复性得到的mRCL并不表现出明显的酯合成活性。在复性过程中添加表面活性剂DDM可以将mRCL酯合成活性提高32倍。(3)将酯合成活性得到显著提高的脂肪酶应用于其它非水相催化反应。DDM和无机盐激活的r27RCL在有机溶剂和无溶剂体系中分别催化生物香料己酸乙酯和生物柴油油酸乙酯的合成,初始反应速率和转化率均得到显著提高,该结果验证了该酶制剂在催化非水相酯合成反应中的有效性和适用性。
【图文】：

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第一章绪论酶非水相催化酶和非水相催化概述（lipase，EC3.1.1.3）是一类酯键水解酶，在生物体内催化甘油三酰基酯的应的脂肪酸、甘油单酯或双酯和甘油。脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生肪酶易于放大生产和纯化，所以是工业酶制剂的主要来源。一般而言，脂肪溶性较差，当水相中的底物分子足够多时会聚集形成一个相，脂肪酶位于底上催化酯键断裂。当油-水界面出现后，脂肪酶的催化速率会显著提高，该活”，是脂肪酶的独特性质[1, 2]。脂肪酶催化的水解反应在洗涤剂添加剂、油制品的增香和风味强化、纸制品的脱墨以及绢纺、皮毛、皮革的脱脂等方面[3]。

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但未表现出酯合成活性。孙舒扬[67]在分离纯化华根霉固态发酵和液态发酵产生的酯酶的研究中发现，两种发酵过程均产生与细胞膜结合并具有高酯合成活性脂肪酶（型华根霉脂肪酶），此外同时产生多种酯合成活性较低的同功酶。通过野生型华根霉菌株生产酯合成脂肪酶在工业应用上存在两个问题。首先是丝状量难以满足工业化生产的需要，常规育种方法和发酵条件优化难以显著提升；其次肪酶同工酶的存在，分离目标脂肪酶非常困难。随着分子生物学技术的发展，越来物脂肪酶通过基因工程的方法得到异源表达，为工业生产奠定了基础[68-71]。2 华根霉脂肪酶基因的克隆及异源表达Yu 等[72]以华根霉基因组为模板通过 PCR 技术扩增得到了开放阅读框全长 1170 bp 华酶全基因序列，为华根霉脂肪酶的异源表达和分子改造的研究奠定基础。与其它已霉脂肪酶基因序列比对，对华根霉脂肪酶全基因序列的分析结果表明华根霉脂肪酶由基酸组成，其中包含 26 个氨基酸的信号肽序列，，94 个氨基酸的前导肽序列和 269 个的成熟肽序列[72, 73]。该基因编码的成熟肽脂肪酶的 N 端序列与野生型华根霉脂肪酶列分析结果一致[67, 72, 74]，由此可知野生型华根霉脂肪酶由脂肪酶成熟肽基因编码。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925.6

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