植物源油酯类物质对粘细菌发酵生产埃博霉素的影响

发布时间：2020-06-18 07:32

【摘要】：粘细菌是自然界中广泛存在的具有复杂的多细胞行为的革兰氏阴性细菌,具有滑动的特点,受多种信号途径的调控。粘细菌次级代谢产物丰富,具有多样性与生物活性,很多次级代谢产物拥有很大的应用价值,其在药物开发中的吸引力仅次于放线菌。但是由于其具有聚团生长、代时长的特点,且培养及遗传操作困难,因此其基因功能和天然化合物生产能力得不到有效开发,这严重影响了粘细菌的研究进展。纤维堆囊菌是一类能降解纤维素的粘细菌,其次级代谢产物埃博霉素是一类具有抗肿瘤活性的聚酮类的大环内酯类化合物。埃博霉素具有促进微管聚合、抑制其解聚的活性,对肿瘤细胞的作用机制与抗癌药物紫杉醇的相似,但相比于紫杉醇,埃博霉素具有水溶性好,细胞毒性更小的优点,这引起了广大研究者对埃博霉素的关注与研究。目前,国外已将埃博霉素的衍生物应用到临床,但由于埃博霉素的生产技术不成熟,产量低,导致埃博霉素的应用和开发受到限制。引起这一现象主要原因在于纤维堆囊菌的代时长、培养及遗传操作困难、细胞产量低,因此本实验室主要从埃博霉素基因簇的遗传操作和埃博霉素的发酵优化两方面解决这一问题。近些年,油酯类物质被广泛应用到生物发酵的过程中,其中包括一些抗生素的生物发酵。已经报道的可添加植物源油酯进行发酵的抗生素主要有:红霉素、泰乐菌素、多杀菌素、头孢菌素C以及其他的抗生素,且它们的产量均得到不同程度提高。本课题研究了油酯类物质对埃博霉素产量的影响并初步探索其影响机制,本课题所使用的发酵菌株均是由本实验室通过对埃博霉素基因簇的遗传操作获得的高产突变菌株。本研究的工作主要包括三部分:一、探究油酯类物质对突变菌株发酵埃博霉素能力的影响根据前期对埃博霉素基础发酵培养基的优化,最终确定培养基组分为:酪蛋白胨 1%,酵母浸提粉 0.5%,MgSO4·7H2O0.1%,MOPS10mM,吸附树脂 2%(v/v),pH7.5。对突变菌株进行发酵培养,30℃,200rpm培养8d检测出埃博霉素的产量在1.5 mg/L左右。在已优化的发酵培养基的基础上添加油酸甲酯和油酯类物质均能提高埃博霉素的产量,其产量提高到10 mg/L左右。油酯类物质的添加解决了埃博霉素产量低且不易被检测的问题。二、油酯类物质的不同添加方式对突变菌株发酵埃博霉素的影响将油酯类物质混合添加到发酵培养基中,埃博霉素的产量提高,其中混合添加油酸甲酯和菜籽油的提高效果最好,埃博霉素产量提高到15 mg/L。若分批添加发酵所需最佳的油量,发现分批添加油酯类物质并没有进一步提高埃博霉素产量。在Oh添加油酯类物质,发酵一段时间后补加油酯类物质,发现补加少量的油酯类物质能进一步提高埃博霉素的产量,使埃博霉素产量高于15 mg/L。若分批补料添加不同浓度油酯类物质,花生油的作用效果优于其他的油酯类物质,花生油以0.2%的浓度分批添加时埃博霉素的产量最高,可达18 mg/L。在分批补料添加不同浓度油酯类物质的同时添加适量的丙酸钠和微量元素均能提高埃博霉素的产量。三、初步探索油酯类物质提高埃博霉素产量的机制通过检测添加油酯类物质发酵过程中菌体浓度的变化、埃博霉素产量的变化、埃博霉素基因簇转录水平和菌体脂肪酶含量的变化,初步探索油酯类物质在发酵过程中的影响机制。研究发现,油酯类物质的添加提高了发酵液的菌体浓度,促进了菌体的生长,延长了菌体稳定期。RT-qPCR结果显示,油酯类物质的添加促进了埃博霉素基因簇转录水平的提高,且各个模块基因的转录量均提高显著。利用ELISA双抗夹心法,检测到油酯类物质发酵过程中脂肪酶含量的变化情况,根据检测结果可以得知添加油酯类物质提高了脂肪酶的含量,为后续研究油酯类物质的作用机制提供了参考。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.6
【图文】：

形态图,粘细菌,子实体,酪蛋白

其营养细胞呈杆状，长度在３－６｜ｉｍ之间，宽度为０．７－１．０叫１［３］。粘细菌能在固逡逑体表面滑动，并且具有复杂的多细胞行为。当在饥饿的环境下无法获得充足的营逡逑养物质时粘细菌会形成特异的子实体（图１－１）。这些子实体能够形成接近１０５逡逑个个体，并且不同种属间的个体从它们的长度，形状和颜色上表现出广泛的差异逡逑性［５］。逡逑图１－１邋ａ图表示粘细菌的子实体；ｂ图是粘细菌在酪蛋白胨平板上的形态［６］逡逑粘细菌是种好氧异养型菌，在其的研究初期人们认为粘细菌不能在液体环境逡逑中培养，后被证明此观点是错误的。虽然粘细菌在环境中普遍存在，并且在一些逡逑极端环境下也能生长，但是只有在营养丰富的条件下，粘细菌才呈现出良好的生逡逑长状态。实验室中常用蛋白胨、酵母粉、大豆粉等营养成分较丰富的营养物质充逡逑当粘细菌的营养原料。经研宄发现，粘细菌的最佳发酵温度为２８°Ｃ－３０°Ｃ，ｐＨ为逡逑７．０－８．０之间晸。在粘细菌的培养过程中存在聚团生长、菌落生长缓慢、不能形逡逑１逡逑

粘细菌,总量,纤维堆囊菌,溶纤

要包括：肽类、大环、芳香族等。逡逑由德国国家生物技术研宄中心（ＧＢＦ）对粘细菌收集的结果显示，粘细菌种逡逑类繁多，大约分离出７０００株（图１－２），根据利用的底物不同主要可以分为两大逡逑类别：溶纤维素和溶细菌，前者是利用纤维素为底物，后者是利用细菌作为底物逡逑提供自身生长所需的营养物质。粘细菌所拥有的属中大部分属于溶菌类，溶纤维逡逑素类的主要为堆囊菌属，堆囊菌主要包括纤维堆囊菌和逡逑紧实堆囊菌取＇ｗｍｃｗｎｐｏｓ／／佊）两大类［１７－〗８］。逡逑Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ邋１８，８％逡逑Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ邋２３．２％逡逑／逦Ｉ邋ｖ逡逑Ｐｏｌｙａｎｇｉｕｍ邋１．９％邋／逦ｃ邋／．逦＼逡逑Ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｃｅｓ逦如吵丨咖逦＼逡逑ｆ＾ｓＬ－４逡逑／邋＊邋ｏｔｈｅｒｓ邋４邋４％逡逑Ｃｏｒａｌｏｃｏｃｃｕｓ邋２３，１％＼邋Ｃｙ＾ｂａｃｔ？Ｗ＾Ｖ＇＇－－邋ｓｔｉｇｍａｔｅｌｉａ邋２，０％逡逑／逦；邋＼逦７邋Ａｒｃｈａｎｇｉｕｍ邋４ｒ６％逡逑Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ５，４％逡逑Ｉ逡逑Ｐ＾ｔ／ｘｏｃｏｃｃｕｓ邋１５，５％逡逑图１－２邋ＧＢＦ收集的各种粘细菌所占的粘细菌总量的比例结果［１９］逡逑纤维堆囊菌是粘细菌中一类能降解纤维素的革兰氏阴性菌

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