大肠杆菌共培养系统生产酪醇糖苷

发布时间：2020-06-21 14:07

【摘要】：糖苷是一类重要的次级代谢天然产物,具有多种药理活性,在医药、食品、保健品领域都有广泛应用。糖苷的生物合成需要两种前体,由于苷元和活性糖供给的限制,单菌合成糖苷的效率往往很低。本文以红景天苷和淫羊藿次苷D2为例,采用汇聚线路,由苯丙氨酸缺陷的BMT菌株合成酪醇,酪氨酸缺陷的BMS菌株合成UDP-葡萄糖和糖苷,组成大肠杆菌共培养系统,研究了途径构建和共培养系统的优化控制。我们构建酮基脱羧酶基因kdc4的组成型表达载体,得到菌株BMT21,摇瓶发酵36h,可生产酪醇1.46g/L。在UDP-葡萄糖强化菌株BMS9中,表达拟南芥来源的密码优化的糖基转移酶基因synugt85a1,得到菌株BMS23,摇瓶发酵36h,可将500mg/L酪醇几乎全部转化,生成927.04mg/L红景天苷。BMT21与BMS23共培养后,无需添加苯丙氨酸和酪氨酸,在极限培养基上能形成稳定良好的互养生长关系。为了解除共培养系统中两个菌株对碳源的竞争,在敲除ptsG基因的基础上,敲除manZ基因,构建了优先利用木糖的菌株BMT23;敲除xylA基因,构建了只能利用葡萄糖的菌株BMS24。研究了葡萄糖木糖比例、接种比例对共培养系统和糖苷合成的影响,优化了发酵控制。在最适条件下,共培养系统摇瓶发酵36h可合成红景天苷670.58mg/L,只有少量酪醇积累。在5L发酵罐中补料发酵129h,红景天苷产量达6.03g/L,没有中间产物积累。为了验证共培养系统的灵活性,选用非特异性的糖基转移酶YjiC,同时生产红景天苷和淫羊藿次苷D2。经过对碳源、接种比例等发酵条件优化,在最适条件下摇瓶发酵48h,可生产403.45mg/L红景天苷,409.34mg/L淫羊藿次苷D2。在5L发酵罐中补料发酵84h,红景天苷产量为2.27g/L,淫羊藿次苷D2产量分为2.38g/L。将苷元和活性糖由两种菌株分别合成,组成共培养系统,是一种非常有潜力的生产糖苷策略,而且对其他复杂天然产物的高效合成也有借鉴价值。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ929
【图文】：

红景天苷,化学结构

图 1-1 红景天苷化学结构Fig.1-1 Chemical Structure of Salidroside理活性药理活性，主要体现在以下五个方面。。近年来，关于红景天苷保护神经系统证明红景天苷可以通过抑制线粒体代谢核糖体蛋白 S6 激酶[3]磷脂酰肌醇-3 激酶a2+超载，下调半胱天冬酶-3[5]的表达等机和皮质神经元由于损伤因子及氧化因子疗仍然是恢复神经损伤主要手段，相关疗神经脑缺血性和神经变性疾病的新药年来，动物模型试验证实了红景天苷可

酪醇,酪氨酸

图 1-2 酪醇合成途径Fig. 1-2 Tyrosol biosynthetic pathways酪氨酸脱羧途径合成酪醇需经过三步，首先在酪氨酸脱羧酶（tyrosinedecarboxylase，TyrDC）催化下合成酪胺，再经单氨氧化酶（tyramine oxidase，TYO）催化合成 4-羟基苯乙醛（4-hydroxyphenylacetaldehyde，4HPAA），最后由对羟基乙醇脱氢酶（ethanol dehydrogenase, ADH）还原合成酪醇。Keasling 课题组[19]于 2012 年利用罂粟（Papaver somniferum）来源的酪氨酸脱羧酶 TyrDC和来自藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的酪氨酸单氧化酶 TYO，以及大肠杆菌内源的乙醇脱氢酶构建酪醇生物合成途径，在大肠杆菌中首次实现了酪醇的从头合成。酪氨酸转氨代谢途径合成酪醇需要经过三步，酪氨酸在酪氨酸转氨酶（ tyrosine transaminase, TAT ）的催化下生成对羟基苯丙酮酸（ 4-Hydroxyphenylpyruvate, 4HPP ），然后在丙酮酸脱羧酶 (2-keto aciddecarboxylase, KDC)催化下生成 4HPAA，最后还原生成酪醇。需要的大肠杆菌

【参考文献】