土壤中产ε-聚赖氨酸菌株的筛

发布时间：2020-06-21 10:48

【摘要】：ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由25~35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成的氨基酸同型聚合物,分子质量通常为3500~4500 Da。ε-PL具有广泛的抑菌谱,且稳定性强,安全高效。在日本、韩国和美国等国家已经获得广泛应用;在国内,2014年,ε-PL获得新型食品添加剂许可,且已经有少数厂家实现了工业化生产。为了进一步推进ε-PL的工业化生产,系统地探究ε-PL具有深远的意义。本文从产ε-PL的菌种筛选研究出发,经菌种鉴定后,通过摇瓶及发酵罐初步发酵考察了筛选菌株的ε-PL生产性能;通过分离提取工艺的初步探索,确定其提取分离的关键制约因素;为后期的菌种育种研究和提取工艺优化奠定基础。本论文的具体研究内容如下:(1)采集土壤样品制成菌液,使用含2 g/Lε-PL固体培养基,并结合亚甲基蓝透明圈初筛耐ε-PL的菌株,获得耐ε-PL生长的菌株;采用复合抗生素抑菌剂富集放线菌,结合亚甲基蓝透明圈初筛可能产ε-PL的放线菌。利用ε-PL与碘化铋钾试剂能发生特殊的沉淀反应,分离得到5株产ε-PL的菌株,经菌落形态和培养特征及16 S rDNA分析,鉴定为:1株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens,1株蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus,1株链霉菌属菌株Streptomyces sp.,1株糖多孢属菌株Saccharopolyspora sp.,1株白色链霉菌Streptomyces albulus。(2)对5株菌株摇瓶发酵,通过高效液相色谱进行定量分析,ε-PL产量分别为0.08 g/L,0.06 g/L,0.70 g/L,0.82 g/L,1.56 g/L。对其中1株ε-PL产量最高的白色链霉菌Streptomyces albulus wzj5进行5L发酵罐发酵,产量为6.99 g/L。提取发酵产物进行薄层层析分析,结果表明,郑州拜纳佛公司的ε-PL和本试验粗提取的ε-PL的水解产物以及赖氨酸标品,三者在层析板上具有相同的Rf值,证明Streptomyces albulus wzj5的发酵产物就是赖氨酸的聚合物。(3)通过单因素试验优化了ε-PL的提取中三个重要步骤,分别是加热去蛋白、离子交换、活性炭去色素。去发酵液中杂蛋白蛋白的最优条件为:pH=3.0,时间=90min,温度=95℃,利用此优化条件去除了发酵液中80.18%的杂蛋白;离子交换的最优条件为:初始pH=9.0,树脂用量=125 g/L,上样流速与洗脱流速均为3 ml/min,根据此条件进行离子交换,ε-PL回收率平均为77.19%;去色素最优条件为:待脱色液pH=4.0,水浴温度=75℃,水浴时间=120 min,活性炭添加量=2%(w/v)。根据此条件进行色素去除,ε-PL回收率平均为92.18%,脱色率平均为83.06%。优化后的提取工艺ε-PL总回收率达31.36%。取提纯后的ε-PL固体粉末,用其进行对大肠杆菌的抑菌试验,最小抑菌浓度为0.25 mg/ml。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ929
【图文】：

亚甲基蓝,细菌菌落,透明圈

TTACGACTT-3'）进行扩增，测序所得 16S 序列比较，构建系统发育树。筛加 ε-PL添加 2 g/L 的ε-PL，于 30℃培养 7 d。SG 平板。亚甲基蓝是一种碱性染料，菌落电作用排斥亚甲基蓝而形成透明圈，且带正的研究经验表明，目标物的生产菌株通常，本研究尝试通过筛选ε-PL 的耐受菌株从而此原理筛选出的两株在含亚甲基蓝培养基落长出的时间与其湿润，粘稠，易挑起的形

透明圈,亚甲基蓝,放线菌,菌落

产 ε-聚赖氨酸菌株的筛选、发酵及其发酵剂氨酸的菌种多集中在北里胞菌属，高[66]。故添加抑制细菌、霉菌、酵啶酮酸对抑制细菌有效，制霉菌素记 5 d 后长出的菌落接种至含 0 三株菌透明圈较大的菌株。如图他两株菌株。此三株菌株从形态特蔓延，不易挑起。初步判断可能是

【参考文献】