芽孢杆菌HG224产表面活性剂的理化性质及其在黄姜皂苷提取中的应用研究

发布时间：2020-07-16 03:40

【摘要】：黄姜皂素是合成数百种甾体激素类药物的重要前体,传统酸水解工艺生产皂素存在“污染大、收率低、成本高”等瓶颈,严重威胁南水北调中线工程水质安全。课题组经多年科技攻关,提出生物法水提富集黄姜皂苷转化为皂素的绿色新工艺,摒弃了传统酸水解过程,显著降低了污染及生产成本。进一步研究发现,表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)可大幅提高黄姜皂苷水提取率,但SDS的添加会引入新的污染,且不利于后续黄姜皂苷的生物转化。因此,亟需寻找环境友好的生物表面活性剂。为此,本论文以降低水溶性体系表面张力为筛选指标,获得了1株能分泌表面活性物质的芽孢杆菌HG224,并对该物质的理化性质及其在黄姜皂苷提取中的应用进行了研究,取得如下结果:(1)芽孢杆菌HG224产表面活性物质的分离与初步鉴定采用酸沉淀结合有机溶剂提取,从芽孢杆菌HG224发酵液上清中分离获得具有表面活性的物质,进一步采用薄层色谱、傅里叶红外光谱以及高分辨液质联用技术进行分析,确定该物质为4种C13~C15的Surfactin同系物组成的混合脂肽类表面活性剂。(2)芽孢杆菌HG224产脂肽类表面活性剂的理化性质分析根据表面张力-脂肽浓度曲线确定了该脂肽类表面活性剂的临界胶团浓度为30 mg/L。通过乳化性能、排油圈检测分析发现,该物质乳化指数可稳定保持在60%以上,排油圈直径可达8.2 cm,具有良好的乳化性能和排油性能;带电性检测分析发现该物质为一种阴离子表面活性剂。进一步分析该物质在不同条件下的稳定性,发现该物质可以分别在0~100℃、pH 4~12以及高盐浓度(0~18%NaCl,w/v)条件下保持稳定的表面活性和乳化性能。(3)芽孢杆菌HG224产脂肽类表面活性剂的发酵工艺优化通过优化芽孢杆菌HG224的发酵参数和培养基组分,发现在接种量3%(v/v)、初始pH 7.5、培养温度31℃、装液量30 mL/250 mL的摇瓶条件下,且培养基中碳源为蔗糖、氮源为黄豆饼粉,并添加铜离子的情况下,可大幅提高脂肽发酵产量;进一步对培养基中氮源、碳源、铜离子浓度三个主要影响因子进行正交实验优化,确定了优化的浓度为:蔗糖20 g/L,黄豆饼粉60 g/L,Cu~(2+)0.5 mg/L。采用上述优化的发酵条件,脂肽样品产量高达5.74 g/L,为优化前(0.33 g/L)的17.39倍,其发酵液的排油圈直径达12.4 cm,较优化前增加了4.2 cm。(4)芽孢杆菌HG224产脂肽类表面活性剂在黄姜皂苷提取中的应用利用芽孢杆菌HG224产脂肽发酵液提取黄姜皂苷,结果显示其黄姜皂苷水提取率较直接水提取提高了45.16%,采用发酵液提取黄姜皂苷的方法具有很好的应用价值;利用不同浓度脂肽样品处理黄姜干粉水悬液发现,90 mg/L脂肽样品水溶液对黄姜皂苷水提取率较直接水提取提高了11.27%,进一步证实脂肽类表面活性剂对黄姜皂苷的水提取有促进作用。通过高效液相色谱和高分辨液质联用分析确定,经脂肽样品处理后的黄姜干粉水悬液水相中三种极性较小的螺甾烷型皂苷含量较直接水提取明显增加,进一步确定脂肽类表面活性剂具有促进黄姜皂苷水提取的作用。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ423;TQ28
【图文】：

工艺流程图,酸水解,工艺流程

图 0-2 黄姜甾体皂苷主要类型（左：螺旋甾烷型；右：呋喃甾烷型）Fig. 1-2 Main types of steroidal saponin of turmeric(Left: spiral decane type; right: furan decane type)黄姜皂苷及其衍生物是一类具有多种药理活性的物质，具有抗炎、抗病毒抗真菌、抗过敏、免疫调节等作用[9]，对心、肝、肾、脑、胃和肠有一定保护作10-13]；对代谢疾病包括糖尿病、骨质疏松症、肥胖症、高尿酸血症有一定治疗果[14]；此外还能诱导引起乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、肾癌等细胞死亡[15-19]；有改善心脏肥大、治疗关节炎等生理作用[20]。1.2 黄姜皂素的生产方法目前，黄姜皂素的生产多采用基于 Rothrok 等[21]提出的先水解后萃取的改良法（即直接酸水解工艺[22]，如图 1-3），主要通过加入无机酸使 C3 和 C26 位的链糖基水解从而获得皂素。1

谱图,产生物表面活性剂,芽孢杆菌,薄层层析

芽孢杆菌 HG224 产生物表面活性剂的薄层层析显汽，自然光；2：罗丹明 B，254 nm；3：茚三酮， TLC colour results of the surfactants secreted by Bacilpor, natural light; 2:Rhodamine B,254 nm;3:Ninhydrin蒸汽反应 2 min 后，薄层板上样品点呈现为黄经罗丹明 B 显色后，在 254 nm 紫外光照射下有脂肪酸分子[84]；未经处理的样品喷洒茚三说明样品中不含游离氨基，但对薄层板上的加热显色，薄层板出现紫红色斑点，说明样样品中含有具有闭合肽键的脂肽类表面活性样品的 FT-IR 谱图如图 2-2 所示。1316.7874.991207.551160.831076.61895.80656.94\01.0 8:49:0

排油,芽孢杆菌,表面活性剂,性能

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11020406080EI24(%)时间（d）-2 芽孢杆菌 HG224 产的脂肽类表面活性剂的乳化mulsifying ability of lipopeptides secreted by Bacillus g/L 的脂肽样品溶液具有良好的乳化性能，乳10 d 后，该脂肽样品溶液对液体石蜡的乳化指。剂排油性能脂肽类表面活性剂的排油性能进行测定，结

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