富硒碱性茶蛋白ACE抑制肽的制备、分离纯化及结构鉴定

发布时间：2020-07-16 17:56

【摘要】：硒是动物、植物和微生物营养中重要的一种微量元素,它的降血压作用主要是由硒蛋白或硒多肽来体现。茶多肽具有一定的降血压活性,是介于蛋白质和氨基酸之间的肽类,和其他的生物分子相比,具有良好的生物活性和多样性,并且其安全性更高,降血压活性更显著。将硒同茶蛋白多肽有效的结合起来研究,开发富硒茶蛋白多肽将会有较高的应用价值。本文对富硒茶蛋白和普通不富硒茶蛋白进行了提取、纯化,富硒碱溶性茶蛋白ACE抑制肽和不富硒茶蛋白ACE抑制肽制备、分离纯化及结构进行了相关研究,主要研究结果如下:(1)茶粉经过脱色、去多糖等处理后,在0.1M NaOH,4 mg/ml PVPP,温度60℃,料液比1:25的条件下提取茶蛋白,Se-TP在洗脱条件下得到四个组分,分别为Se-TPⅠ(Tris-HCl)、Se-TPⅡ(0.2M NaCl)、Se-TPⅢ(0.3M NaCl)、Se-TPⅣ(0.6M NaCl),其中组分Se-TPⅢACE抑制活性较高,为41.3%。而TP在洗脱条件下得到三个组分,分别为TPⅠ(Tris-HCl)、TPⅡ(0.3M NaCl)、TPⅢ(0.5M NaCl),其中组分TPⅢ的ACE抑制活性最高为61.34%。由于随着蛋白的纯化,硒含量下降,另外ACE降血压活性受蛋白的氨基酸组成、含量、序列的影响,不同条件下层析色谱对蛋白的吸附能力不同,因此,可能导致纯化后不富硒蛋白组活性更高。加热预处理有利于活性基团的暴露,更容易酶解得到活性序列,综合考虑,选择预处理的条件为100℃水浴5min。五种蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)酶解后,检测各酶解液的ACE抑制活性和水解度,最终选择碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行复合酶解。(2)复合酶解的单因素实验显示:五种因素(p H、温度、加酶量、反应时间,酶比例),在一定范围内,酶解产物的活性随着五因素的递增,先增后减。五因素对酶解工艺的影响主要体现在对蛋白酶酶活的影响和活性氨基酸的暴露上。复合酶解的最佳酶解工艺为:最佳酶解条件:pH 8,温度60℃,加酶量3500U,时间5h,酶比例(碱性:中性)为2:5,普通不富硒碱溶性茶蛋白酶解肽混合物ACE抑制活性IC_(50)为25.95mg/ml,天然富硒碱溶性茶蛋白酶解肽混合物ACE抑制活性IC_(50)为17.07mg/ml。TPep经超滤分离得到片四个组分,分别为TPepⅠ(1kDa)、TPepⅡ(1~10 kDa)、TPepⅢ(10~100 kDa)、TPepⅣ(100 kDa),其中组分TPepⅠ(1 kDa)的ACE抑制活性最高,为93.29%。Se-TPep经超滤分离得到四个组分,分别为Se-TPepⅠ(1 kDa)、Se-TPepⅡ(1~10 kDa)、Se-TPepⅢ(10~100 kDa)、Se-TPepⅣ(100 kDa),其中组分Se-TPepⅡ(1~10 kDa)的活性最高,为94.78%。超滤所得Se-TPepⅠ和TPepⅠ经凝胶Sephadex G-25洗脱均得到两种组分,且组分Ⅰ含量和ACE抑制活性较高,富硒组分硒含量为2.25PPM,ACE抑制活性IC_(50)为0.93mg/ml,而不富硒组分ACE抑制活性IC_(50)为1.45mg/ml。(3)由电镜图可以清晰直观地看到样品的外形外貌,天然普通蛋白和多肽片状形态更为厚重,而多肽形态较蛋白而言更为疏松轻薄。蛋白和多肽样品中均检测到N-H键、O-H键、基团NH_2、C=O键、C-N键、芳环C=C键、C-O键、C-S键等。并且在C-S键的位置,天然富硒茶蛋白和多肽样品的吸收强度增加,可能S被Se取代,受到C-Se键的影响。综合分析,可能是带有部分芳香族氨基酸的蛋白和多肽。通过Se-TPepⅠ和TPepⅠ的氨基酸组成结果来看,Se-TPepⅠ中各氨基酸的含量比TPepⅠ要高,并且在N端含有Gly、Ala、Val、Arg等活性氨基酸,其中以Ala、Val的含量最高。C端含有Leu、Tyr、Phe等疏水性氨基酸,其中以Leu的含量最高。且硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的形式与蛋白结合,而在天然富硒茶多肽样品中没有检测到半胱氨酸,只有蛋氨酸。组分Se-TPep(1k)经过NanoLC-Q-TOF-MS分析,得到一条多肽序列AETGEIKGHY,分子量为1103.53。组分Se-TPepⅡ(1~10 kDa)得到两条多肽序列,其中一条和组分Se-TPep(1k)的多肽完全相同,另外一条多肽序列LGVPIVMHDY,其分子量为1158.57,并且含有硒常结合的氨基酸Met。组分TPepⅠ(1 kDa)得到一条多肽序列LQPSLGFP,分子量为857.46。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ936.16
【图文】：

标准曲线,标准曲线,硒含量测定,蛋白含量

性茶蛋白的提取、纯化及 ACE 抑制活性的研究上海师范大学与分析白的蛋白含量及硒含量测定的结果表 2-5 茶蛋白的蛋白含量及硒含量测定的结果Table 2-5 Results of Determination of Protein Content andSelenium Content of Tea Protein 硒含量（PPM）可溶性蛋白含量（%）总蛋白含 2.82 11.42 白 0.13 10.78 知，根据考马斯亮蓝法测定标准蛋白（BSA）制作的+0.0006, R2=0.9999,测定茶蛋白溶液中蛋白质含量，其结

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R2=0.9999,测定茶蛋白溶液中蛋白质含量，其结果图 2-1 考马斯亮蓝法测蛋白的标准曲线Figure 2-1 Standard curve of Coomassie brilliant blue assay protein度与 Se 荧光强度的标准曲线：Y=0.0111X+0.0929，R2=0.99

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