酪酸梭菌的诱变育种及其1,3-丙二醇的发酵与耐受机制的研究

发布时间：2020-07-16 18:57

【摘要】：1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是一种重要的化学品,在食品、药品、化工等领域具有广泛应用。微生物合成法是一种成本低廉、环境友好的新型合成方法,但天然的1,3-PD生产菌株都面临产物耐受性低、副产物对原菌的毒性等问题。Clostridium butyricum作为其中一种生产菌株,具有菌种为益生菌和不需要昂贵辅酶添加的优势。本研究针对C.butyricum转化甘油生产1,3-PD中的产物低耐受性问题,对原始菌株进行了NTG和ARTP相结合的物理化学复合诱变的方法,获得了一株1,3-PD高耐受菌株;随后,利用C.butyricum高耐受菌株发酵生产1,3-PD,优化了甘油转化1,3-PD的条件。最后,对原始株和突变株进行多组学的分析,挖掘与1,3-PD耐受性相关的基因与蛋白,初步验证部分蛋白质的功能。主要的研究结果如下:(1)采用一系列1,3-PD浓度确定了原始菌株C.butyricum XYB11的初始耐受性,随后利用NTG和ARTP的物理化学复合诱变,得到了突变株C.butyricum YP855,其1,3-PD耐受性相比原始出发菌株提高了30.8%。(2)采用单因素法和响应面法对突变株C.butyricum YP855进行1,3-PD分批发酵条件的优化,得到1,3-PD分批发酵的最佳条件为:甘油浓度81.0 g/L,酵母提取物浓度1.6 g/L,发酵时间为21.7 h,发酵温度为36.7℃。在最佳条件下进行1,3-PD的分批发酵,得到1,3-PD的最终产量为37.20 g/L,产率为0.51 g/g,生产强度为1.71 g/(L·h),比原始菌株分别提高了29.48%、18%和29%。(3)对C.butyricum XYB11进行了全基因组的测序,预测并注释了基因结构与功能;将C.butyricum XYB11原始株和突变株进行组学分析,结合全基因组测序结果,由转录组学数据获得了差异表达的基因,由蛋白组学数据得到了差异表达的蛋白,通过转录组学和蛋白组学的联合分析,开展了差异基因和差异蛋白的GO类别、KEGG代谢通路等富集分析与比较,并从功能的角度分析关键基因和蛋白与C.butyricum的1,3-PD耐受性关系,初步筛选得到7个可能与C.butyricum的1,3-PD耐受性相关的关键基因,从而用于后续基因功能的初步验证。(4)从C.butyricum XYB11中克隆得到上述的7个关键基因,利用无缝克隆技术成功构建了7个重组质粒pET-gene,转化各个重组质粒,在E.coli中成功表达了这些蛋白,对各个重组菌1,3-PD的耐受性进行了检测,初步验证了这些关键蛋白的功能,得知组氨酸激酶、ABC转运器、异柠檬酸脱氢酶和甲基接受化学趋向性蛋白可能与C.butyricum的1,3-PD耐受性相关。结合多组学结果,分析了筛选出的关键蛋白与耐受性相关的可能分子机制。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ923
【图文】：

过程图,生物法生产,过程

3-PD 的作为溶剂用途也较广泛，可以作水基油墨，例如喷墨和丝网油墨，用作食品标记油墨，具有较好的稳定性，打印特性优良[15]。（5）1,3-PD 是有机合成的重要中间体，可用于各种类型的药物，如维生素H 和免疫类等药物的合成，也可作为香料；同时，作为化妆品中的添加物，可作为润肤剂与保湿剂。因此，开发经济高效的 1,3-PD 的生产方式对于各项工业发展都有重要的意义[16]。目前，合成 1,3-PD 的常规方法是通过丙烯醛的水合，以及环氧乙烷的加氢甲酰化[17]，这些化学合成方法无论从经济角度还是生态角度来看，都具有成本高和环境不友好等的缺点。由 DuPont 公司开发的甘油到 1,3-PD 的酶促转化开创了 1,3-PD 合成的新纪元，迄今为止，许多企业和科研机构已经开发了许多方法来从粗制或纯甘油中生产 1,3-PD，通过优化天然菌株或开发基因工程菌株的方法，可有效提高生物法生产 1,3-PD 的产量，其结构简式和反应简式如图 1.1 所示。

通路图,异源

图 1.2 甘油的代谢通路图[28]Fig 1.2 Metabolic pathways of glycerol catabolism源宿主的基因工程菌转化代谢工程技术的发展，开发了许多新的工程菌来实现 1,3-PD，大肠杆菌（Escherichia coli）作为最常用的蛋白表达异源宿 1,3-PD 异源宿主生产研究最透彻的系统。将 E. coli 用于 1,3杜邦和 Genencor 公司合作开发的[30]，底物为葡萄糖，主要通，将酿酒酵母来源的可转化葡萄糖为甘油的基因和 K. pneum基因克隆到E. coli K12中，同时利用E. coli自有的1,3-PDDH编码），实现了 1,3-PD 的高效合成，产量达到 130 g/L，实现ng 等[31]采用相似的方法，为了改善 1,3-PD 的工业生产，在设计了由 clts857 阻遏物调节的温度敏感性 λ 噬菌体 PL和 P

高效液相色谱,混合标准,高效液相色谱,样品

将这些标准样品放入液相色谱仪进样系统中，分别得到峰面积，运用（Version 2018，OriginLab，US），以浓度为横轴，以峰面积为纵轴，与峰面积的散点图，并将散点图进行线性拟合，得到拟合曲线，即为各标准曲线。再用母液配制一个一定浓度的混合标准样品，在色谱仪中进以验证确保四种物质可以在色谱柱中得到很好的分离效果。结果与讨论标准样品的液相结果及标准曲线将配制好的混标进样检测，得到的吸收峰如图 3.1 所示，由图可知，四在上述色谱条件下得到了较好的分离。结合各化合物浓度大小和单标样可知，四种待测化合物在该条件下的保留时间（Rt）依次为：甘油，4.61，5.06 min；1,3-PD，5.92 min；丁酸，6.56 min。

【参考文献】