高产表面活性素枯草芽孢杆菌的ARTP选育、发酵条件优化及产物特性研究

发布时间：2020-07-17 10:02

【摘要】：表面活性素(surfactin)是来自于微生物的脂肽类次级代谢产物,具有优良的表面活性和乳化性,是一种良好的生物表面活性剂。此外表面活性素一般还具有抗菌、抗病毒和抗癌等生物活性,因此在食品工业、医药行业和环境修复等领域有着广泛的应用价值。但是天然菌株产生表面活性素的能力通常很低,限制了其在生产中的应用,因此通过诱变菌株提高表面活性素的产量有着十分重大的意义。本研究首先利用常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变枯草芽孢杆菌,筛选高产表面活性素的突变株,并采用基因组学等方法初步研究其诱变机制;其次,对突变株的发酵工艺分别进行单因素和响应面优化试验,获得最优发酵工艺条件;对最优发酵工艺条件下突变株发酵产生的表面活性素进行提取,鉴定其结构,并研究其功能特性。本文的主要研究内容及结果如下:(1)ARTP诱变选育高产表面活性素菌株的研究。根据表面活性素产量从6株芽孢杆菌中通过对比选择枯草芽孢杆菌CICC 10721为出发菌株,其表面活性素产量为0.73 mg/mL,利用ARTP对其进行诱变育种,结果表明在诱变时间24 s、功率100 W、载气量10 SLM(标况下升每分钟,Standard Litre per Minute)的条件下,ARTP对菌株致死率为92.21%。在该条件下以溶血圈初筛、摇瓶发酵复筛的方法筛选获得突变菌株M45,其溶血圈直径与菌落直径比值达到6.11,表面活性素产量相对出发菌株提高了35.6%,达到0.99mg/L且传代稳定。通过对比出发菌株和突变菌株的发酵动力学参数,发现突变菌株M45的最大菌体干重、最大生长速率以及产物表面活性素合成参数等均大于出发菌,说明突变菌株M45的生长性能和发酵产表面活性素性能均高于出发菌株。(2)对ARTP诱变枯草芽孢杆菌CICC 10721的机制进行初步研究。首先,通过扫描电镜观察发现ARTP诱变处理后的菌体形态发生改变,出现弯曲、突出、凹陷、变长以及破损等现象,另外,诱变后的菌体胞内钙离子浓度显著增加,说明ARTP处理改变了枯草芽孢杆菌细胞膜的通透性。通过基因组重测序分析,发现突变株M45相对于出发菌株发生了66个SNP非同义突变位点,涉及到30个基因,将差异基因编码的氨基酸序列分别在GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)数据库中进行比对,发现差异基因中dltC、ytrC和ycbP等与膜组成相关,OTC、argF和argI基因与氨基酸转运和代谢相关,argF、yobL和pbpA基因与有机酸的结合与代谢有关,fevC、ytrC、secDF和agG基因涉及到细胞膜转运。(3)以表面活性素产量为主要评价指标,对突变菌株M45进行了发酵工艺的优化。单因素试验结果表明,影响表面活性素产量的主要因素是初始pH值、接种量和葡萄糖含量,通过响应面优化试验后得到最优发酵工艺条件为:葡萄糖含量4.35%(W/V)、硝酸铵含量0.8%(W/V)、接种量4.68%(V/V)、初始pH值7.14、发酵温度30℃、摇床转速180 r/min,在此条件下,表面活性素产量为2.15 mg/mL,相比优化前提高了148%。(4)对突变菌株M45产生的表面活性素进行了结构鉴定和功能特性的研究。高效液相色谱分析发现从发酵液提取的表面活性素纯度达到89.3%,通过氨基酸组成分析和液相色谱-质谱联用分析等发现其中主要的表面活性素类型有:C_(12)2 surfactin、C_(13)3 surfactin、C_(14)4 surfactin、C_(15)5 surfactin和C_(16)6 surfactin。对表面活性素提取物的表面活性、乳化性、抗氧化性等研究发现:表面活性素提取物的临界胶束浓度约为0.1 mg/mL,该浓度下溶液表面张力比对照组降低56%;5mg/mL的表面活性素提取物溶液乳化指数即可达75%,且在5 d后仅下降2.7%;提取物对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除的IC_(50)浓度为4.42 mg/mL。研究表面活性素提取物对结肠癌细胞(Caco-2)、肝癌细胞(HepG2)和宫颈癌细胞(Hela)增殖的抑制效应,发现表面活性素提取物对三种癌细胞增殖均具有显著的抑制作用,其作用24 h后抑制增殖的IC_(50)浓度分别为293.11、90.94和81.67μg/mL。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ423;TQ920.6
【图文】：

分子结构图,表面活性素

其中表面活性素是发现最早且生物表面活性最域具有广泛的应用价值而备受关注[5,6]。从枯草芽孢杆菌的培养液中首次发现表面活性素，由七肽上第 7 个氨基酸残基通过内酯键与 12接而成，其结构如图 1.1 所示[8]。表面活性素的6 和 7 位；而亲水性谷氨酸和天冬氨酸位于第 1。表面活性素的同分异构体在相同位置上的氨，其异构体 A/B/C 的第七位氨基酸分别为亮氨其独特的结构，表面活性素是一种非常强大的力从 72 mN/m 降低至 27 mN/m，同时具有较好面活性素还具有抗菌活性，但没有明显的杀菌性素具有抗病毒、抗肿瘤、抗凝血和抑制酶等活

表面活性素,突变菌株,传代稳定性,复筛

M43 M80 M101 M116 M156 M1730.00.20.40.60.8面活性素产量（表gmmL/菌株编号对照图 2.6 复筛菌株中的表面活性素产量Fig. 2.6 surfactin yield of secondary screening strains产表面活性素传代稳定性结果.7 中复筛出的 M36、M38、M45、M56、M77、M79和 M量提高较明显的菌株进行产表面活性素传代稳定性试验稳定性有一定的差异，结果如图 2.7所示。

诱变处理,扫描电镜图

江苏大学硕士学位论文示，其中 A1、A2 为对照组，B1、B2 为 ARTP 处理组，可以看出对照组菌体形状规则，细胞膜无破损现象，正处于分裂过程。ARTP 处理后的菌体发生以下几种变化：一些细胞形状发生不同程度的弯曲、突出、凹陷和变长，一些细胞有破裂的情况，说明 ARTP 发射的等离子流对枯草芽孢杆菌 CICC 10721的细胞膜有一定的刺激作用，导致细胞形态的改变，一些不耐受菌会直接破裂死亡，而一些抗性较强的菌则会发生不同的改变并存活下来，其生长增殖可能因而受到促进。

【参考文献】