瓦伦西亚橘烯生物转化生成圆柚酮的研究

发布时间：2020-07-19 11:42

【摘要】：圆柚酮为倍半萜烯类化合物,属雅槛蓝烷系的双环倍半萜酮。圆柚酮在低浓度时表现出浓郁的柚子香气,并带有甜橙、木香香韵,但味苦,其气味阈值较低,仅为1μg/L。圆柚酮因具有宜人的柑橘香气而受到人们的关注,自其被发现以来,关于圆柚酮的天然分布、晶体结构及其多种立体异构体的香味特征,都得到了广泛的研究。由于它在天然产物中含量很低,而且其具有立体异构体,几乎无法分离得到,且提取成本很高,所以圆柚酮的提取及应用受到很大限制。目前国内外有关瓦伦西亚橘烯生物转化生产圆柚酮的研究还很少,本实验研究旨在通过比较三株不同微生物菌种转化瓦伦西亚橘烯生产圆柚酮的效果,筛选适于转化瓦伦西亚橘烯生产圆柚酮的菌种,增加瓦伦西亚橘烯转化生成圆柚酮的转化量,并提高其转化率,降低天然香料圆柚酮的生产成本。对产物圆柚酮进行分离纯化,并对转化过程中的酶进行初步探索。1.利用SPME-GC-MS技术,分析检测黑曲霉(Aspergillus niger),毛霉(Mucor sp.)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)转化瓦伦西亚橘烯的产物,并比较三株菌株转化瓦伦西亚橘烯生成圆柚酮的效果。实验结果表明,三株菌种黑曲霉(Aspergillus niger),毛霉(Mucor sp.),解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)均能对瓦伦西亚橘烯进行转化并生成圆柚酮,同时生成α-松油醇,香芹酮等物质。其中解脂耶氏酵母转化瓦伦西亚橘烯生成圆柚酮的产量最高,达252.52±15.79 mg/L,转化率也最高,达27.45%±1.72%。其次为黑曲霉和毛霉,产量分别为140.94±30.26 mg/L和137.67±14.02 mg/L,转化率分别为15.32%±3.29%和15.45%±3.36%。2.通过正交试验对解脂耶氏酵母的发酵培养基进行条件优化,得到培养基最佳优化组合为:乳糖40 g/L,蛋白胨15 g/L,FeSO_4·7H_2O 0.6 g/L。解脂耶氏酵母具有较高的生物转化瓦伦西亚橘烯生成圆柚酮的效果,优化后的该菌培养基转化生成圆柚酮的浓度可达457.32±76.11 mg/L,转化率为49%,较未优化的培养基相比转化率提高了21.55%。在单因素工艺优化实验基础上,确定转化条件研究优化组合为添加底物的时间为菌种转化36 h时,添加菌种的浓度为5%,添加底物浓度为920mg/L,底物添加后的转化时间为36 h,选用水溶性有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)做助溶剂,添加浓度为10%。转化条件的温度为32℃,转速150 rpm,pH为初始5.30。最终得到产物圆柚酮的转化量为531.16±21.30 mg/L,转化率为57.73±2.31%。相比于培养基优化之后圆柚酮转化量457.32±76.11 mg/L,转化率为49%,其转化效率提高了8.73%,较最初转化率提高29.92%。3.通过高速逆流色谱法(HSCCC)法对解脂耶氏酵母转化瓦伦西亚橘烯生成的圆柚酮进行分离纯化。通过使用高速逆流色谱分离纯化样品中圆柚酮成分,选择出合适的两相溶剂体系,确定较佳的溶剂分离条件。筛选正己烷-氯仿-乙腈、正己烷-二氯甲烷-乙腈、正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-乙腈的3种不同比例的非水性两相溶剂系统以及正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的2种不同比例的含水两相溶剂系统进行高速逆流色谱实验。考察各个溶剂系统对分离的影响,综合考虑分离所得圆柚酮纯度及洗脱时间,选择正己烷-甲醇-水(5:4:1),以上相为固定相,下相为流动相进行洗脱,此时圆柚酮的洗脱时间为280-340 min,GC-MS分析产品纯度为53.74%。最终进行质谱和红外的结构鉴定,确定其为圆柚酮。4.本部分实验主要是对解脂耶氏酵母的蛋白进行纯化。实验研究六种不同种类的抑制剂都会抑制生物转化,使圆柚酮浓度下降,其中邻二氮菲对瓦伦西亚橘烯转化生成圆柚酮的抑制作用最强,抑制率达到12.28%。实验测定转化瓦伦西亚橘烯生成圆柚酮的酶即菌体活性蛋白成分大部分在菌体破碎液的上清中。用9个不同梯度的百分比含量的硫酸铵((NH_4)_2SO_4)来沉淀菌株解脂耶氏酵母的菌体破碎液,确定最佳沉淀浓度百分比为40%。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ654
【图文】：

晶体结构,分子结构,香味,香气

图 1-1 圆柚酮的分子结构（左）以及圆柚酮的晶体结构（右） Molecular structure of nootkatone (left) and crystal structure of nootkato于宜人的柑橘香气，在研究中而引起了人们的普遍关注。有、晶体结构以及多种立体异构体的香味特征，都得到了广泛的

西亚,柚类

图 1-2 瓦伦西亚橘烯转化为圆柚酮（1，瓦伦西亚橘烯；2，圆柚醇；3，圆柚酮）Fig.1-2 Conversion of valencene to nootkatone (1, valencene, 2, nootkatol, 3, nootkato圆柚酮的应用酮具有浓郁的柚类香气，它可以作为天然的香精香料添加到食品中去作为柚类香气的衡量指标(Shaw 1981)。近年来，圆柚酮关于生理作用越重要。它的味道除了应用于香水外，最近实验研究发现圆柚酮也有毒性活动向毁灭性的地下白蚁。然而，与自然产品相关的当前成本使工业应用。圆柚酮作为一种天然的倍半萜酮，其对两种主要的储藏害米象甲具有接触毒性和驱避性，对玉米和水稻的危害明显小于溶剂处表明圆柚酮具有驱虫效果，对玉米杂草的驱避率为 46.3~93.1%，水稻为 39.2~67.2%（Mao et al 2010）。研究表明，圆柚酮对福尔摩沙地下llo et al 2001; Zhu et al 2001; Ibrahim et al 2004)，以及一种携带莱姆病名

标准曲线,标准曲线,气相色谱-质谱联用,西亚

图 2-3 圆柚酮标准曲线Fig.2-3 The standard curve of nootkatone利用分析纯无水乙醇（分析纯）对标准的圆柚酮进行稀释，利用气相色谱-质谱联用进行测定，以峰面积为纵坐标，以瓦伦西亚烯浓度为横坐标进行测定。结果如

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