枯草芽孢杆菌发酵产聚谷氨酸及其分离纯化的研究

发布时间：2020-07-24 08:15

【摘要】：γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)是一种由微生物发酵生产得到的水溶性高聚物,具有优良的吸水,保水性、生物相容性和可降解性。作为一种新型高分子材料,,γ-PGA及其衍生物在食品、药品、环保等方面具有广阔的开发与应用前景。然而,目前居高不下的市售价格制约和阻碍了γ-PGA及其产品的深入开发与应用。导致这样状况的主要原因是微生物发酵制备γ-PGA的产率较低及其分离成本过高。为此,本文通过对比研究固/液态不同发酵方式,系统揭示固/液态发酵方式对γ-PGA生产的影响。在此基础上,通过对发酵条件和分离、纯化工艺的优化改进,提升γ-PGA的生产与分离效率,降低y-PGA的生产成本,推动γ-PGA及其产品的开发与应用。具体结果如下:(1)液态发酵研究:独立因素研究显示蔗糖和胰蛋白胨分别为最佳碳、氮源,底物L-谷氨酸对y-PGA的合成影响显著。进一步应用响应面设计优化,获最佳培养基组成(蔗糖28.87 g/L、胰蛋白胨17.56 g/L和L-谷氨酸为15.26 g/L);对发酵条件进行优化,得最适发酵条件为:接种量7.5%,装液量20%,pH 7,发酵温度37℃。在发酵36 h时γ-PGA的产量最大,可达17.42 g/L,是优化前产量的4.98倍。(2)固态发酵研究:主要研究固态基质类型、营养基质破碎程度、固态基质/营养基质、接种量和相关发酵条件等因素对γ-PGA生产的独立效应。结果发现珍珠岩为最佳固体基质,碾碎(八分之一)的大豆与珍珠岩最佳混匀比例为1:1,每100 g固态基质初始加水量为6 mL,在初始pH值为7培养基中,接种量8%,37℃发酵36h后,γ-PGA最大产量为79.12 g/Kg,是优化前产量的1.86倍。(3)NK对γ-PGA生产影响的研究:在分析纳豆激酶(NK)与y-PGA的生产进程曲线时发现,γ-PGA的生产高峰期迟于NK;进一步对比分析液态发酵和固态发酵生产的γ-PGA的分子量情况,结果显示液体发酵生产的γ-PGA分子量比固态发酵的要大,且分布相对集中。因此,初步推断NK可能影响γ-PGA的生产。基于液态发酵方式,通过添加外源NK,探究NK对y-PGA生产的影响。结果表明NK可能通过底物竞争和降解γ-PGA的方式抑制γ-PGA的生产。(4)y-PGA分离、纯化的研究:利用乙醇提取获得y-PGA粗品,再经丙酮、透析和苯酚处理,优化γ-PGA的分离、纯化工艺。结果表明,加入3倍体积的丙酮能够有效提高y-PGA提取率与纯度;透析处理能够去除小分子蛋白与杂质;苯酚处理后进一步提高y-PGA纯度。利用茚三酮比色法检测,纯化后的γ-PGA纯度较高,达到89.12%。纸层析检测结果表明纯化后的γ-PGA主要由单一的谷氨酸组成,不含有其他游离氨基酸。SDS-PAGE凝胶电泳显示,γ-PGA分子量在690-700 kD之间,聚合度较为集中。论文研究结果为微生物发酵生产γ-PGA及其分离纯化的研究提供参考依据,一定程度上降低了γ-PGA的生产成本,推动了γ-PGA的应用。
【学位授予单位】：安徽工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6;TQ317
【图文】：

标准曲线,标准曲线,碳源

Ｆｉｇ．２－１邋ｙ－ＰＧＡ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ逡逑以不同浓度的Ｙ－ＰＧＡ纯品为标准液，通过测定ＯＤ２１６ｎｍ的吸光度值来确定逡逑丫－ＰＧＡ的浓度。图２－１为紫外分光光度计测定ｙ－ＰＧＡ标准品（浓度１０－２００邋ｎｇ／ｍＬ）逡逑的标准曲线。由图可知，其Ｒ２为９９．９％，模型有统计学意义。逡逑２．３．２液态发酵培养组分的优化逡逑２．３．２．１碳源种类的影响逡逑６邋１逦逡逑５．逦．逡逑Ｐ逡逑Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑－ｆ逦Ｉ逦Ｉ逦ｉ逦Ｉ逡逑／／／／逦Ｖ／／／逦／／／／逦／／／ｊ逡逑＾逦柋逦悐逦＾＾逡逑0邋邋ｖ／＾Ａ逦Ｖ／＾Ａ逦＼／／／＼逦Ｙ／＾／２逦＿逡逑葡萄精逦苣格逦麦芽楂逦甘油逦柠榷酸逡逑碳源种类逡逑图２－２碳源对ｙ－ＰＧＡ生产的影响逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｃａｒｂｏｎ邋ｓｏｕｒｃｅ邋ｏｎ邋ｙ－ＰＧＡ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑２４逡逑

碳源,液态发酵,麦芽

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氮源,有机氮源,碳源,无机氮源

他结构成分，而且为菌体增殖与目的产物代谢合成提供必需的能源。不同生产菌逡逑株对碳源的需求不同，碳源的种类与浓度对Ｙ－ＰＧＡ的形成也有不同的影响，选逡逑择合适的碳源与浓度十分重要。如图２－２显示，相比于其他碳源，蔗糖为最佳碳逡逑源，其次为麦芽糖和葡萄糖，效果最差的为甘油。最终，选择蔗糖作为发酵培养逡逑基的最佳碳源，用于后续的研宄、生产。逡逑２Ｊ．２．２氮源种类的影响逡逑－Ｉ逡逑！５：邋｜邋＿逡逑，Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑１１Ｂ逦１逦１逦Ｍ逦１逡逑拽蛋白胨逦牛肉胥逦ｓｉ母胥逦ｍ化铵逦尿素逡逑图２－３氮源对ｙ－ＰＧＡ生产的影响逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｎｉｔｒｏｇｅｎ邋ｓｏｕｒｃｅ邋ｏｎ邋ｙ－ＰＧＡ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，在发酵过程中，调节氮源的逡逑种类与浓度对菌体生长和产物合成有着至关重要的作用。培养基中常见氮源可分逡逑为有机氮源与无机氮源，如图２－３所示，在ｙ－ＰＧＡ发酵生产过程中，有机氮源逡逑的利用率比无机氮源的利用率更高，主要原因在于，相较于无机氮源，有机氮源逡逑成分复杂。有机氮源含有丰富的蛋白质、氨基酸、多肽类等物质，为Ｙ－ＰＧＡ发逡逑酵生产提供全面营养和充足能源。在有机氮源中

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